育齡期多囊卵巢綜合征患者陰道微生態特征分析

馬雪蓮 陸月紅 嚴李萍 馬英英 陳昊 丁杰鋒 應群華 王立昌

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）是一種以雄激素過多和胰島素抵抗（insulin resistance,IR）為特征，伴生殖功能障礙和糖代謝異常的一種分泌性紊亂綜合征[1]，育齡人群的患病率約為5%～10%[2]。該病以激素失衡和卵巢功能障礙為特點，是育齡期女性無排卵型不孕的主要原因。女性的陰道微生態系統是由陰道的解剖結構、微生物菌群、局部免疫系統及機體的內分泌調節功能組成，而陰道是一個開放性的自然腔道，極易受外界環境和內在因素侵擾，當機體免疫力下降、體內激素波動、陰道pH值變化時，陰道內的菌群就會出現變化，構成菌群紊亂[3]。本研究通過對比生殖科就診的育齡期PCOS患者和非內分泌疾病患者的陰道微生態相關指標的差異，分析PCOS患者菌群檢出情況，旨在探討PCOS患者激素紊亂對陰道微生態的影響，以期為臨床精細化治療提供幫助，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取紹興市婦幼保健院2019年1月至2021年1月收治的317例18～45歲育齡期PCOS患者作為研究組，PCOS診斷標準參照2003鹿特丹標準[4]。選取同期生殖科就診的200例18～45歲育齡不孕女性作為對照組。所有研究對象3個月內未使用激素類藥物，并且排除PCOS外其他排卵障礙引起的內分泌疾病以及資料不全或檢測項目不全的患者。分組：（1）將PCOS患者根據病情分成3組：普通PCOS組144例，IR組103例 [穩態模型胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR；空腹胰島素×空腹血糖/22.5[5-6]）≥2.68為IR[7]]；高雄激素血癥（hyperandrogenemia,HA）組 70例[血清總睪酮（T）≥1.97 nmol/ml，結合游離雄激素指數（FAI；T×100/性激素結合蛋白）＞6.4[8-9]]；（2）為探討IR患者陰道微生態失調與激素的相關性，排除數據不全的患者后，分別選取IR組患者95例和普通PCOS組患者94例進行雌二醇（E2）、孕酮（P）的分析。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 陰道分泌物采集 兩組患者入組后由專業護士進行取樣（陰道分泌物）：PCOS組在卵泡期取樣，對照組于月經結束3～7 d后取樣。明確取樣前3 d不性交，陰道不使用任何藥物，無陰道出血，否則更改取樣日期。標本采集方法：取膀胱截石位，將陰道窺器以少量0.9%氯化鈉溶液潤滑后放入陰道內，暴露子宮頸，用2根干棉簽從陰道上1/3側壁刮取分泌物，置于試管內。另取1根無菌棉簽于相同部位刮取分泌物留做細菌培養。

1.3 陰道分泌物檢測 （1）形態學檢測：用無菌滴管吸取浸潤液1滴滴于載玻片上，于40倍高倍顯微鏡下觀察陰道分泌物的清潔度、假絲酵母菌、線索細胞及乳桿菌情況。將該玻片干燥、固定后行革蘭染色，于1 000倍油鏡下觀察菌群密集度、多樣性及優勢菌情況。（2）功能學檢測：用留取陰道分泌物的另1根干棉簽，加適量稀釋液，用碩世bPR-2014A陰道炎自動檢測儀檢測需氧菌、厭氧菌、真菌等代謝產物、酶的活性及pH值。（3）細菌培養：用取樣拭子接種相應培養基，培養后用梅里埃VITEK儀鑒定確認菌種。

1.4 性激素、FPG和胰島素檢測 抽取空腹靜脈血10 ml檢測性激素、FPG和胰島素，FPG采用貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀檢測；空腹胰島素采用深圳新產業生物科技MAGLUMI2000化學發光分析儀檢測；T、E2、P采用雅培ARCHITECT全自動化學發光免疫分析儀檢測。

1.5 觀察指標 比較兩組患者陰道微生態指標：菌群密集度、菌群多樣性、優勢菌、pH值及炎癥情況。比較PCOS各亞組患者的陰道分泌物菌群檢出情況，分析陰道微生態是否失調。

1.5.1 正常陰道微生態標準 （1）微生態正常：陰道菌群的密集度為Ⅱ～Ⅲ級，多樣性為Ⅱ～Ⅲ級，優勢菌為乳桿菌，陰道pH值為3.8～4.5，乳桿菌功能正常（過氧化氫酶分泌正常），白細胞＜10個/HP（高倍視野下的上皮細胞周圍），白細胞酯酶等陰性。（2）微生態失調：任何一項出現異常即診斷為陰道微生態失調。

1.5.2 陰道菌群密集度標準 Ⅰ級（1+）：1～9個/油鏡；Ⅱ級（2+）：10～99個/油鏡；Ⅲ級（3+）：100 個及以上/油鏡；Ⅳ級（4+）：細菌聚集成團或密集覆蓋黏膜上皮細胞/油鏡。

1.5.3 陰道菌群多樣性標準 Ⅰ級（1+）：1～3種/油鏡；Ⅱ級（2+）：4～6 種/油鏡；Ⅲ級（3+）：7～9 種細菌/油鏡；Ⅳ級（4+）：10 種及以上/油鏡。

1.5.4 細菌性陰道病（bacterial vaginitis,BV）的診斷標準 參考Nugent評分[10]標準，結合培養結果確認診斷，Nugent評分 0～3分為正常，4～6分為中間型 BV，≥7分為BV，具體評分標準見表1。

表1 Nugent評分標準

1.5.5 外陰陰道假絲酵母菌病（vulvovaginal candidiasis,VVC）的診斷標準 顯微鏡檢見到菌絲或孢子，結合培養結果確認診斷。

1.5.6 需氧菌性陰道炎（aerobic vaginitis,AV）的診斷標準 目前尚無規范化、公認的AV診斷標準。診斷主要根據臨床特征及Donders評分（陰道分泌物顯微鏡下Donders評分≥3分），結合培養結果確認。

1.6 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。正態分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數檢驗；計數資料用例表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組和對照組患者陰道微生態指標的比較 兩組患者菌群密集度、多樣性、pH值、優勢菌比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），而研究組白細胞＞10個/HP占比、陰道微生態失調率均明顯高于對照組（均P＜0.05），見表 2。

表2 研究組和對照組患者陰道微生態指標的比較

2.2 PCOS各亞組與對照組患者陰道分泌物菌群檢出率的比較 普通PCOS組陰道分泌物菌群檢出率與對照組差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而在PCOS各亞組中，HA組的非特異性炎癥檢出率、IR組的BV檢出率以及這兩個亞組中混合感染檢出率、陰道微生態失調率與普通PCOS組相比均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 PCOS各亞組與對照組患者陰道分泌物菌群檢出率的比較[例（%）]

2.3 PCOS各亞組與對照組Nugent評分比較 PCOS各亞組與對照組Nugent評分的差異均有統計學意義（均P＜0.05）。Nugent評分為0～3分和≥7分的IR組患者占比與普通PCOS組患者占比的差異均有統計學意義（均P＜0.05），說明IR組患者陰道中擁有健康菌群（乳桿菌）的占比較普通PCOS組低，同時患BV的占比較普通PCOS組高；而HA組各分段患者占比與普通PCOS組差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表4。

表4 PCOS各亞組與對照組Nugent評分比較[例（%）]

2.4 IR組與普通PCOS組患者E2、P水平比較 IR組的E2水平顯著低于普通PCOS組（P＜0.05），而P水平與普通PCOS組的差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 IR組與普通PCOS組患者E2、P水平比較

2.5 PCOS患者各亞組陰道微生態特征 普通PCOS患者處于PCOS發病早期，激素紊亂程度較輕，菌群基本正常，陰道微生態與非內分泌疾病患者差異不大。發生HA和IR的患者已進入PCOS中期，HA患者常處于全身慢性炎癥狀態，非特異性炎癥患者陰道炎癥明顯，白細胞出現聚集，基底旁上皮細胞可見，提示炎癥導致陰道黏膜受損。IR患者常患BV，患者陰道乳桿菌缺如，厭氧菌增多。PCOS中后期，IR患者Nugent評分高者多見，IR與HA患者常發生混合感染。HA混合感染患者陰道炎癥較IR患者明顯，具備HA慢性炎癥的特征。HA合并IR患者已進展到PCOS晚期，此時激素紊亂加劇，陰道微生態可同時具備上述兩者特征，菌群失調嚴重，最終發展成難治性陰道炎。典型患者的陰道微生態見圖1-6（插頁）。

圖1 27歲普通多囊卵巢綜合征PCOS患者陰道微生態（菌群基本正常，以乳桿菌為主）

圖2 27歲高雄激素血癥（HA）患者陰道微生態（診斷為非特異性陰道炎，炎癥明顯，低倍鏡下白細胞滿視野，高倍鏡下白細胞＞10個/HP，并有部分聚集，出現基底旁上皮細胞，陰道內乳桿菌減少，未發現明顯致病菌）

圖3 25歲胰島素抵抗（IR）多囊卵巢綜合征患者陰道微生態（診斷為細菌性陰道炎，破碎的上皮細胞上聚集了大量厭氧菌，炎性白細胞較少）

圖4 28歲胰島素抵抗（IR）多囊卵巢綜合征患者陰道微生態 [診斷為混合感染：細菌性陰道病（BV）+外陰陰道假絲酵母菌病（VVC），菌群失調程度較高，Nugent評分為9分]

圖5 27歲高雄激素血癥（HA）多囊卵巢綜合征患者陰道微生態 [診斷為混合感染：細菌性陰道病（BV）+外陰陰道假絲酵母菌病（VVC）+炎癥，白細胞部分聚集，陰道炎癥較IR混合感染者明顯，具備HA慢性炎癥特征]

圖6 31歲胰島素抵抗（IR）合并高雄激素血癥（HA）多囊卵巢綜合征患者的陰道微生態（診斷為細菌性陰道炎合并炎癥，陰道炎癥加重，并出現大量基底旁細胞）

3 討論

育齡期女性的陰道微生態環境與體內激素平衡關系密切，而PCOS是一種生殖和代謝功能紊亂性疾病，其本質是由激素失衡引起的，因此陰道微生態失調的情況較普通患者更易發生。本文通過對比兩組患者陰道微生態指標后發現，PCOS患者的陰道炎癥情況明顯高于對照組，兩組患者的陰道微生態失調率差異有統計學意義。通過對PCOS患者各亞組菌群的進一步分析發現，普通PCOS組患者陰道菌群基本正常，陰道微生態失調率與對照組差異無統計學意義，且失調的菌群與對照組比較也無差異，這可能與其尚處于PCOS早期，紊亂的激素尚未對菌群造成明顯影響有關。

發生于PCOS中期的IR組和HA組患者陰道微生態失調率明顯高于普通PCOS組，其中HA組的非特異性炎癥檢出率、IR組的BV檢出率，以及兩組的混合感染檢出率與普通PCOS組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），由此筆者推斷HA和IR引起的激素紊亂可能是PCOS患者陰道慢性炎癥和BV頻發的主因。

進入PCOS中期，性激素結合蛋白減少，游離睪酮增多，形成了HA，而HA被認為是PCOS形成的初始原因和主要特征，由于患者體內低黃體酮和高雄激素狀態均可引起機體免疫系統異常活化，導致患者體內產生多種炎性因子和自身抗體，使PCOS患者常處于全身的慢性炎癥狀態。研究顯示，與BMI匹配的正常婦女相比，大部分PCOS婦女外周血中CRP、IL-1β、IL-17、IL-18、TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1（MCP1）、可溶性內皮白細胞黏附分子（sE-selectin）和可溶性細胞間黏附分子（sICAM）等炎性因子水平顯著升高，致使PCOS患者機體處于慢性炎性狀態[11]。本研究結果顯示，HA組非特異性炎癥率明顯高于IR組和普通PCOS組，可能與此關系密切。

胰島素生物轉導途徑缺陷發生IR，而IR是導致PCOS發病的關鍵環節[12]，據報道，60%的PCOS患者(包括肥胖和非肥胖人群)存在IR[13]。目前已知IR參與到了PCOS發生及進展過程中，是PCOS的主要病理特征之一,也是導致PCOS患者代謝功能紊亂以及生殖內分泌失調的重要原因[14-15]。因此，當PCOS病理進程導致機體的免疫穩態受到破壞時，陰道的局部免疫勢必會受到影響，而目前人們普遍認為免疫因素可能在BV的發病機制中發揮重要作用。本研究結果顯示，IR組BV檢出率明顯高于普通PCOS組，可能與普通PCOS進展到IR后，全身免疫失衡加劇，導致陰道免疫功能受損，進而影響陰道微生態，引發以厭氧菌為主的菌群失調。同時，通過進一步對比了PCOS各亞組在Nugent各評分段的占比后發現，IR組Nugent評分低分段（0～3分）的占比（61.17%）最少，與普通PCOS組（74.31%）的差異有統計學意義（P＜0.05），說明其健康菌群偏少；而Nugent評分高分段（≥7分）的占比（27.18%）最多，與普通PCOS組（16.67%）有顯著差異，說明菌群失調程度高。這與表4中發現IR患者的E2明顯低于普通PCOS組的結論相吻合。研究表明，雌、孕激素在陰道微生態系統的變化中起著重要的作用，其中以雌激素最為主要，它對陰道菌群的構成、陰道pH值均起決定性影響[16]。因此，IR患者雌激素的分泌可能也是受到了激素紊亂加劇的影響，導致其陰道正常菌群功能受損，數量下降，更易發生BV。本研究同時發現，IR組和HA組的混合感染發生率明顯高于普通PCOS組，這可能是由于進入PCOS中后期，患者長期內分泌紊亂難以糾正，陰道炎遷延不愈所致。

近年來大量研究顯示，PCOS患者體內存在慢性低度炎癥，并且這種炎癥狀態與IR的發生、發展有關，炎性因子能夠參與胰島素信號通路干擾其信號轉導從而誘導IR[17]。而持續的IR導致高胰島素水平可抑制肝臟性激素結合蛋白的產生，致使血清游離睪酮濃度升高，結果表現為明顯的HA臨床特征[18]。因此，PCOS患者HA可引起機體慢性炎癥，促進IR，而慢性炎癥和IR又進一步加劇PCOS的病理進程，促進雄激素的分泌。研究證實IR是HA發生和進展的原因之一[19]。由此筆者推斷IR合并HA患者的激素紊亂會更劇烈，而陰道菌群受其影響失調程度或許也會更嚴重。然而由于臨床PCOS確診后治療的干預，導致進展到此階段的初診患者較少，故本研究未能作進一步分析。但從部分患者的陰道微生態圖中發現，IR合并HA患者生殖環境惡劣，其進一步加劇的炎癥和菌群失調可能就是由其嚴重的激素紊亂所致，因此這類患者的陰道微生態更應引起重視。

趙琦等[20]研究認為PCOS是由于血中黃體生成素，雄激素等水平異常，導致無排卵，由于無排卵，體內持續性低水平雌激素狀態，黏膜增厚，糖原分泌增加，酸度增加，有利于念珠菌生長繁殖，或由于陰道不規則出血破壞陰道菌群平衡，導致VVC發病常見，這與本文分析結果不一致。本研究發現PCOS患者的VVC的發病率并未顯著升高，這在對HA和IR分組患者菌群的進一步分析中也得到了證實。研究結論不同可能是他們忽略了PCOS患者雄激素過多這一顯著的內分泌特征。雄激素過多會拮抗雌激素，而PCOS患者的雌激素一直是維持在低水平狀態，無法像正常育齡期婦女那樣每月保持高水平周期性；同時PCOS患者低P的狀態使細菌清除率降低，增加了混合感染的概率。而PCOS患者全身炎癥情況對免疫功能的影響是造成陰道微生態失衡、菌群失調的直接原因。因此，如能進一步增加研究例數，或許會得出更科學的結論。

綜上所述，PCOS患者因激素異常導致全身慢性炎癥，免疫功能紊亂，因此其陰道微生態受其影響更易發生失衡。尤其是IR和HA患者，由于激素紊亂加劇，所形成的不良生殖環境影響了該類患者受孕，更會導致輔助生殖技術難以順利開展。因此，不斷改善此類重點患者激素紊亂的狀況，并持續對其進行陰道微生態監測，才能實現精細化治療，為助孕創建良好的生殖環境，從而減少不良妊娠結局的發生。