咖啡因對糖尿病小鼠腸道菌群的影響

肖 揚，魏桂枝，蔣金泉，王倩梅，尹 文，李俊杰

2型糖尿病(type 2 diabetes， T2DM)是失明、腎臟衰竭、心臟病、中風和下肢截肢的重要原因，臨床上以高血糖、胰島素抵抗和胰腺β細胞代償失調為特征，其發病由遺傳和環境因素共同引起，并且與飲食和生活方式等密切相關[1]。以往的流行病學研究表明適度的攝入咖啡(咖啡因的主要飲食來源)可以降低心血管疾病和T2DM的風險，甚至降低心血管疾病的全因死亡率[2]，但這一結論存在一些爭議，有研究報道了與之相反的結果[3]。因此糖尿病和冠心病患者的飲食指南中通常不推薦咖啡，但鑒于咖啡的神經保護作用[4]，研究其對糖尿病的影響具有重要的價值。有研究表明腸道菌群的失調與代謝綜合征的發展存在復雜的聯系，腸道微生物組分的改變會導致腸道生化環境的不均衡、異常代謝產物的出現、炎癥狀態、葡萄糖代謝的改變，甚至產生胰島素抵抗[5]。動物實驗表明鏈脲霉素(STZ)誘導的糖尿病(DM)小鼠存在腸道菌群失調，腸道中總細菌和某些菌株的比例有所降低，而利用藥物或飲食恢復DM鼠腸道中乳桿菌和雙歧桿菌的比例可以部分改善氧化應激和炎癥狀態，從而發揮一定的降糖作用[6]。Ruiz-Medina等[7]研究指出，給予高劑量咖啡因(30 mg/kg)的小鼠存在一定的生理和行為改變，而長期10 mg/(kg·d)的咖啡因可完全阻止3，4-亞甲基二氧甲基安非他明誘導的神經炎癥，而不引起任何生理或行為改變。因此本研究探討長期保守劑量咖啡因的攝入是否會改變STZ誘導的DM小鼠血糖及腸道菌群，旨在為飲食習慣對糖尿病和腸道微生物的影響提供新證據。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑 咖啡因(BioVision，美國)，葡萄糖測定試劑盒-氧化酶法(上海超研生物)，STZ(北京索萊寶)，檸檬酸緩沖液(北京索萊寶)，土壤DNA抽提試劑盒(廣州美基)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(廣州美基)，ND-2000微量分光光度計(Thermo，美國)，CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，引物合成(上海生工科技)。

1.2DM小鼠模型的建立 SPF級BALB/c雄性小鼠25只，體質量18～22 g，6～8周齡，購自北京華阜康，在進行實驗前測定每只小鼠的血糖均在正常范圍(3.9～6.0 mmol/L)。將每只小鼠單獨飼養并編號(1～25)，自由進食無菌飼料和水。在(24±2)℃的恒溫環境中適應性飼養1周后進行誘導造模，具體操作：小鼠禁食12 h，將STZ溶于10 mg/ml檸檬酸緩沖液(pH 4.2～4.5)后腹腔注射，連續注射3 d，第7天取尾靜脈血測定空腹血糖，連續2 d血糖穩定并>11.1 mmol/L視為造模成功。

1.3DM小鼠模型血糖測定和腸道菌群測序分析

1.3.1血糖測定：造模成功小鼠繼續飼養1周后，隨機選取20只分為非咖啡因組和咖啡因組，每組10只。咖啡因組每天上午8點給予10 mg/kg咖啡因灌胃，非咖啡因組給予等量生理鹽水灌胃。4周后用氧化酶法測定并記錄2組小鼠空腹血糖。

1.3.2腸道菌群測序分析：按照“1.3.1”中的方法分組并喂養4周后取新鮮糞便樣本，具體操作方法為：單手抓取并固定小鼠及其尾部，另一只手輕輕按揉小鼠下腹部，當小鼠應激性排便時，助手迅速用無菌鑷子夾取糞便樣本置入對應編號的無菌凍存管中，并立即保存于-80 ℃冰箱，取小鼠糞便2～3粒，并將糞便樣本編組命名為咖啡因組和非咖啡因組。根據土壤DNA抽提試劑盒的說明方法，從小鼠糞便中提取總DNA，使用微量分光光度計測量DNA的濃度和純度，利用PCR對16S rDNA的V3～V4區進行擴增。設置總反應體系為50 μl，加入1 μl的模板DNA(100 ng)，1 μl的KOD聚合酶， 5 μl的KOD Buffer和5 μl的dNTPs，加入341正向引物(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806反向引物(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)各1.5 μl，進行27個循環的擴增，PCR程序為：95 ℃反應2 min，98 ℃持續10 s，進行27個循環后62 ℃反應30 s，68 ℃反應30 s，最后在68 ℃下延伸10 min。利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化擴增的PCR產物，定量采用QuantiFluorTM熒光計。等量混合純化后的擴增產物并將測序拼頭進行連接，將構建起來的文庫通過Hiseq2500 PE250平臺進行測序分析。得到原始測序結果后過濾掉低質量的reads并去除一些不合格的reads從而獲得clean reads，通過FLASH軟件(version 1.2.11)把成對clean reads組裝為原始tags，利用QIIME軟件(version 1.9.1)將原始tags進行過濾后得到clean tags， clean tags與參考數據庫(http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)比對分析的結果用UCHIME算法進行嵌合體的去除，從而獲得effective tags。使用UPARSE軟件對effective tags進行序列聚類分析，將97%以上的相似性作為一個操作分類單元(OTU)。

2 結果

2.1小鼠血糖和腸道菌群的α多樣性比較 對于α多樣性，Chao 1、ACE指數越大，提示菌群的豐度越高；Shannon指數越大，提示菌群多樣性越高；Simpson指數越大，提示菌群多樣性越低。2組DM小鼠血糖、Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 2組DM小鼠血糖和腸道菌群α多樣性指數比較DM為糖尿病；A為非咖啡因組，B為咖啡因組

2.2攝入咖啡因后DM小鼠腸道菌群β多樣性比較 基于Jaccard距離算法分別進行了PCoA和Adnois檢驗。在PCoA圖中各個樣本的距離越近則代表各樣本的物種組成越相似。本研究結果顯示，2組樣本出現了相互重疊，表明沒有明顯的聚類。見圖2。此外，根據Adnois檢驗進行分析，結果提示，2組DM小鼠腸道菌群β多樣性比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 2組DM小鼠腸道菌群基于Jaccard距離算法的PCoA圖DM為糖尿病；A為非咖啡因組，B為咖啡因組

2.3不同分類學水平腸道菌群組成差異分析 本課題組分析了2組菌群在綱、目、科、屬水平上腸道菌群的群落組成差異；并選取了在每個分類水平上排前10的物種進行表示，通過物種分布堆疊圖的形式表示了不同分類水平2組樣本的物種組成情況。見圖3。在科、屬水平上，咖啡因組乳桿菌的豐度明顯高于非咖啡因組(P<0.05)。見表1～4。

表1 2組DM小鼠腸道菌群豐度最高的前10個綱比較

表2 2組DM小鼠腸道菌群豐度最高的前10個目比較

表3 2組小鼠腸道菌群豐度最高的前10個科比較

表4 2組小鼠腸道菌群豐度最高的前10個屬比較

圖3 2組DM小鼠腸道菌群在綱、目、科、屬水平上的物種相對豐度DM為糖尿病；A為非咖啡因組，B為咖啡因組

3 討論

以往研究報道，適量飲用咖啡對慢性疾病如T2DM、Alzheimers病具有保護效應[8-9]，一項包含18個隊列研究的薈萃分析表明每天一杯咖啡能降低約7%患糖尿病風險[10]，但是這些研究缺乏對具體機制的探索，因此本研究擬解決兩個問題,一是咖啡因的攝入對DM小鼠的血糖發揮了怎樣的作用，是否具有保護效應；二是探討咖啡因的連續攝入對DM小鼠腸道菌群豐度的影響。

本研究結果顯示，連續給予咖啡因28 d后咖啡因組小鼠的血糖值有輕度下降，但與非咖啡因組比較差異無統計學意義。提示咖啡因的連續攝入對DM小鼠的血糖無明顯不利影響，甚至可以輕微的降低血糖水平；因此攝入咖啡因對T2DM患者安全可行，但這與流行病學研究結果存在差異，可能的原因為研究材料和對象不同。咖啡中還含有其他的活性物質如綠原酸、多酚、類黑色素和胡洛巴堿。Hang等[9]發現長期飲用咖啡的女性體內有較高濃度胡洛巴堿，而這與較低的糖尿病風險相關聯。

腸道微生物組在飲食攝入、藥物代謝、維持腸道屏障和胃腸道的結構和功能及預防腸道病原體易位等方面扮演著重要角色[11]。大量證據表明，糖尿病患者的腸道環境發生了變化，其中包括緊密連接結構受損、腸道屏障破壞、腸道中葡萄糖轉運蛋白受損等[12]。

本課題組高通量測序結果表明，在攝入咖啡因前后，2組DM小鼠腸道菌群的α多樣性、β多樣性、Shannon和Simpson指數比較差異無統計學意義；攝入咖啡因前非咖啡因組的Chao1和ACE指數低于咖啡因組，這提示咖啡因并未影響DM小鼠的菌群豐度和多樣性。早期研究發現T2DM患者腸道中的擬桿菌門和厚壁菌門比例增高，并與血糖水平呈正相關[13]，而本課題組測序結果顯示，咖啡因組DM小鼠腸道中擬桿菌的豐度水平較非咖啡因組下降,但差異無統計學意義。由于擬桿菌比例的增加會增強宿主腸道對單糖的攝取，促進肝臟三酰甘油的合成，導致胰島素抵抗[14]，此外擬桿菌還可增強乳酸中琥珀酸、丙酸酯和乙酸鹽的產生，繼而破壞上皮細胞屏障，使病原體進入細胞[15]，因此擬桿菌豐度的下降可能有利于減輕DM小鼠腸道的炎癥和胰島素抵抗狀態，但這有待進一步證實。

本研究結果顯示，咖啡因組DM小鼠腸道中乳桿菌科、屬的豐度明顯高于非咖啡因組。一項橫斷面研究表明，在飲食中添加益生菌可以預防高齡和DM前期肥胖人群T2DM的發展[16]。動物實驗指出給DM小鼠喂食雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌可以降低小鼠空腹和餐后血糖水平，提高葡萄糖耐量水平，這種保護效應的原因是益生菌可以促進短鏈脂肪酸的產生和減輕胰腺炎癥[17]。乳桿菌的這種腸道菌群調節和抗炎能力同樣在DM大鼠中被證實，Cabello-Olmo等[17]指出，含有乳酸菌的發酵食品可以誘導DM大鼠腸道菌群的變化，改善葡萄糖代謝，避免了T2DM的有害影響。因此，咖啡因的攝入有助于DM小鼠腸道乳桿菌屬微生物的增多，這可能有助于降低DM小鼠的血糖水平。

綜上所述，咖啡因的攝入可以輕微降低DM小鼠血糖，而腸道菌群物種豐度和多樣性未發生改變，受咖啡因的影響，DM小鼠腸道中乳桿菌科、屬豐度增加，有利于改善葡萄糖腸道代謝，減輕糖尿病癥狀。本研究結果對DM患者的飲食具有指導作用，在未來的研究中可改變糞便的取材部位，以及通過宏基因組測序等方法，進一步明確咖啡因發揮作用的菌種，并從其產物影響脂肪、糖代謝的角度繼續探究咖啡因對DM的作用機制。