復合干型富硒蘋果酒釀造的響應面工藝優化研究

張婉菁,王漢屏

(西安外事學院，陜西 西安 710077)

近幾年，國內對蘋果酒制備方法研究頗多，眾多企業生產的蘋果酒也相繼上市，但由于國內缺乏對酒用蘋果品種大面積栽培，生產企業通常只能選用鮮食型蘋果來釀造，導致果酒的香氣和口感較為平淡，從而嚴重影響了市場銷量并致使利潤停滯不前。

素有“長壽之王”的硒元素作為人體必需的微量元素在人體以硒酶、硒蛋白的形式存在，其營養價值極高，可清除自由基、排毒、預防衰老、增強免疫力，還可預防各類疾病，如克山病，癌癥，心腦血管疾病等。硒元素廣泛分布于身體肝臟、骨骼肌及脂肪中，美國科學家[1]調查顯示持續6個月每日攝入400 μg硒的老年人其免疫力明顯比對照組的老人有所提高，且體內T細胞增加了27%，NK細胞增加至58%，細胞培養實驗證明能顯著增強中性粒細胞功能；英國研究者表明硒元素可使血清總膽固醇和極低密度膽固醇含量均明顯降低[2]。硒是谷胱甘肽過氧化物酶的活動中心，有清除過氧化物的作用，達到抑制癌細胞生長的作用[2]。同時，硒還具有保護修復心臟維持其功能穩定的重要因素，芬蘭研究者[3]發現，當血清中硒含量水平在45 μg·L-1以下時，心肌梗死、冠心病和心血管疾病的患者死亡風險都會大幅提高；硒在降低糖尿病發病率和生殖系統方面也起有益作用。因此，富硒食品營養保健功能毋庸置疑。而我國大部分地區都是缺硒地區，故中國營養學會推薦每人每日攝入硒50 μg[4]。若能改進完善現有蘋果酒釀造工藝，釀制出高品質、高營養的富硒蘋果酒，必將帶來可觀的市場前景。目前市場上眾多果酒類產品中尚未見到此種復合干型富硒蘋果酒，故大力研究開發此類產品將具有重要的應用價值。

為改善蘋果酒的香氣和口感，用3種不同品種的蘋果和4種其它水果進行了雙重混合，并對其進行發酵工藝優化，制備了一種果香更濃郁、口感更為豐滿的復合干型富硒蘋果酒，其營養價值和風味都得到了明顯提升。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅富士、金冠、澳洲青蘋、桃、葡萄、香蕉、菠蘿；安琪果酒專用酵母菌粉SY；氫氧化鈉，冰糖，果膠酶，檸檬酸，蜂蜜，鹽酸(分析純)，抗壞血酸，SO2。

1.2 儀器設備

AUY220 電子分析天平(Shimadzu Philippines公司)；BL-BJQ-20L全自動機械攪拌不銹鋼液體發酵罐系統(貝朗生物工程設備江蘇有限公司)；HH-US醫用/三用恒溫水箱(上海赫田科學儀器有限公司)；LRH-1500F生化培養箱(上海一恒科學儀器有限公司 )；PHS-3C 數顯酸度計(上海嘉鵬科技有限公司)；ZNHW 電熱套(上海道京儀器有限公司)。

1.3 工藝流程

蘋果一分選一洗凈一去核皮一熱燙一榨汁一過濾一護色—巴氏滅菌—低溫貯藏

葡萄、菠蘿、桃、香蕉一分選一清洗一去皮(除梗)一切分一榨汁一過濾一護色—巴氏滅菌—低溫貯藏

蘋果汁、復合果汁一混合一酶解—澄清一調配—接種一發酵一陳釀一過濾一灌裝一復合果酒

1.4 實驗方法

1.4.1 果汁制備 將分選出的已成熟的紅富士、金冠、澳洲青蘋3個品種的蘋果及桃、葡萄、香蕉、菠蘿分別清洗干凈，切碎分別榨取各自果汁，用抗壞血酸護色，巴氏滅菌后于低溫下分別貯藏備用。

1.4.2 混合調配 采用硒富集技術將各種果汁制成富硒果汁；以4.5～6∶1.5～2∶1～2的比例將富硒紅富士蘋果汁、富硒金冠蘋果汁、富硒澳洲青蘋果汁混合；按57∶10∶18∶10∶5的質量比將富硒混合蘋果汁與先前已榨取好的桃汁、葡萄汁、香蕉汁、菠蘿汁混合，然后用0.5 g·L-1的果膠酶酶解，澄清后分離；用蜂蜜調整混合果汁的糖度，使其含糖量達到18%～25% ，再用檸檬酸調整其酸度，使其酸度達到6～8 g·L-1；

1.4.3 殺菌及酵母活化 向混合果汁中添加60～220 mg·L-1的SO2和450 mg·L-1的安琪果酒專用酵母菌粉SY，在16～28℃條件下靜置發酵，至發酵液的總糖含量達到3.5～4 g·L-1時終止發酵。

1.4.4 封裝 用果膠酶使其酒液澄清，30 min后50℃下靜置數小時直至澄清效果良好，必要時加入1%明膠，膜過濾機精濾，罐裝后經巴氏滅菌即得成品。

1.5 蘋果酒的發酵因素單因素試驗

1.5.1 三種蘋果汁混合比例對復合果酒品質的影響 在糖度為21%，pH值為3.6，酵母量為0.200%的相同條件下，分別取質量比為6∶2∶1，5∶2∶1，4.5∶1.5∶2的富硒紅富士蘋果汁、富硒金冠蘋果汁、富硒澳洲青蘋果汁，在25℃下進行發酵，陳釀后得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種果酒并品評產品。

1.5.2 酵母添加量對發酵工藝的影響 在pH值為3.6，糖度為21%，發酵溫度為25℃的相同條件下，分別接種果汁量0.050%、0.100%、0.150%、0.200%、0.250%的酵母菌進行發酵，以酒精度和硒含量為指標評價果酒發酵效果。

1.5.3 發酵溫度對發酵工藝的影響 在糖度為21%，pH值為3.6，酵母接種量為0.200%，分別選取16℃、19℃，22℃、25℃、28℃的發酵溫度，以酒精度和硒含量為指標評價果酒發酵效果。

1.5.4 SO2用量對發酵工藝的影響 含糖量為21%，初始pH值為3.6，酵母接種量為0.200%，溫度22℃下分別在40、100、140、180、220 mg·L-1的SO2濃度下得到5種不同的果酒，以酒精度和硒含量為指標評價品評發酵效果。

1.6 蘋果酒的發酵因素優化試驗

進行單因素實驗確定各因素最優區間范圍，選取質量比為4.5∶1.5∶2蘋果汁和混合果汁為原料，以酵母菌添加量、發酵溫度、SO2濃度三因素進行響應面優化試驗(見表1)。

表1 響應面試驗因素和水平

2 結果與分析

2.1 三種蘋果汁混合比例對復合果酒品質的影響

由表l可知，得到的三種干型蘋果酒中Ⅲ型的富硒紅富士蘋果汁、富硒金冠蘋果汁、富硒澳洲青蘋果汁的質量比為4.5∶1.5∶2時，所釀造的果酒酒精度最高，分別高出Ⅰ型、Ⅱ型的1.5%和0.2%，Ⅰ型中紅富士所占比例最高故口感偏甜但硒含量較Ⅱ、Ⅲ型低，可能與發酵過程中酵母菌破壞等因素有關，Ⅲ型感官評分最高視為質量最佳(見表2)。因此，選取此質量比的蘋果汁與剩余果汁混合發酵進行單因素及響應面優化實驗。

表2 不同比例的三種蘋果汁的混合發酵結果對比

2.2 酵母添加量對發酵工藝的影響

酵母添加量由0.05%增加至0.20%時，酒精度從10.4%vol迅速增長至11.9%vol，酵母添加量繼續增加至0.25%時，硒含量和酒精度均達最高，分別為75 ug·kg-1，12.01%vol，隨后便開始下降(見圖1)。原因是發酵時接入較多的酵母菌群后迅速繁殖，消耗了酒樣中的大量糖分，從而破壞了發酵環境致使其提前衰老并發生自溶[6]，后期酒精度下降并產生濃厚的酵母味影響酒品質。故選擇果酒發酵酵母接種量0.2%，0.3%，0.4%進行響應面實驗。

圖1 不同酵母添加量對復合蘋果酒酒精度及硒含量的影響

2.3 發酵溫度對發酵工藝的影響

從16℃開始酒精度隨溫度呈直線上升，斜率最大，當發酵液溫度達22℃酒精度最高12%并保持平穩，下降幅度較小且慢，硒含量則從19℃開始平穩上升至22℃達0.074 ug·kg-1，隨后快速下降(見圖2)。試驗表明，溫度在25～28℃時酵母自身生長和繁殖過快，同時消耗大量糖類物質，產生的副代謝產物愈多，使酒精度偏低[7]，對香氣起負面影響。此外，溫度過高時，發酵產生的蘋果酸澀味略重，外觀色澤均受到影響。因此，果酒發酵溫度選擇19℃，22℃，25℃進行響應面實驗。

圖2 不同發酵溫度對復合蘋果酒酒精度及硒含量的影響

2.4 SO2用量對發酵工藝的影響

SO2用量從40 mg·L-1上升至100 mg·L-1，酒精度和硒含量呈直線上升，但SO2用量達到100 mg·L-1后酒精度與硒含量均滑坡式下降(見圖3)。SO2可抑制酒體的雜菌，使用過量也會抑制酵母菌的存活[8]，進而影響果酒的發酵質量和果酒的品質。因此，選用SO2濃度分別為80 mg·L-1，100 mg·L-1，120 mg·L-1進行響應面實驗。

圖3 SO2用量對復合蘋果酒酒精度及硒含量的影響

2.5 響應面試驗設計

在單因素試驗的結果基礎之上，選取酵母添加量(0.2%、0.3%、0.4%)、溫度(19℃、22℃、25℃)、SO2用量(80 mg·L-1、100 mg·L-1、120 mg·L-1)為自變量，酒精度作響應值，根據 Box-Behnken 原理[9]設計三因素三水平的響應面試驗。試驗方案及結果見表3。

表3 響應面優化實驗設計及實驗數據

通過對試驗結果方差分析和模型失擬試驗數據分析得出：首先，模型的F=60.22，并且P 值<0.0001，證明該模型差異性顯著有一定統計學意義。失擬項P=0.2454(>0.05)，表現為不顯著，無統計學意義。最后校正確定相關系數R2=0.9769，修正相關系數R2Adj=0.9471，表明該模型擬合程度較好，總變異中有5.29% 不能用此方程解釋[9](見表5)。綜合上述，可用此模型對試驗結果進行分析預測。

將表3所得實驗數據利用Design-Expert8.0.6.1軟件進行分析(見表4)。

表4 模型失擬試驗

通過對表4分析：由各個因素P值可知，各因素對酒精度的影響大小順序為：SO2用量>酵母菌添加量>發酵溫度，SO2用量P< 0.0001(<0.05)對酒精發酵影響極顯著；其次，酵母菌添加量也對蘋果酒的酒精度有顯著的影響，發酵溫度則在適宜酵母菌生存的范圍內對酒精度的影響不顯著[10]。同時C2小于 0.001(< 0.05)表現為極顯著、B2小于0.05表現顯著。

2.5.1 響應面分析試驗因素的相互影響 發酵溫度和酵母菌添加量對酒精發酵的交互影響不顯著。隨著發酵溫度的上升和酵母菌添加量的增大，酒精度逐漸增加，溫度為 26℃、酵母菌添加量為0.08%～0.10% 時，酒精度最高為13.24%，而當這2個因素的量再次提高后，酒精濃度逐漸下降。發酵溫度和發酵液pH對酒精發酵的交互影響不顯著。

2.5.2 響應面試驗的最佳優化結果及驗證 通過使用 Design expert 8.0.6.1 軟件對試驗得到的數據進行優化并結合試驗條件，優化得到干型蘋果酒酒最佳發酵工藝條件：發酵溫度 21.97 ℃、酵母菌添加量 0.27%、SO2添加量120 mg·L-1。去零取整后的工藝條件：發酵溫度 22℃、酵母菌添加量0.3%、SO2添加量120 mg·L-1。在此最佳條件下進行3次驗證試驗，與軟件優化的結論吻合性較好，具有較高的可信性。

圖4 酵母添加量、發酵溫度、SO2用量交互作用對干型蘋果酒酒精度影響的響應面和等高線

表5 試驗結果方差分析

3 結論

試驗通過響應面設計優選最佳釀酒工藝條件，以期為生產高品質“富硒”復合干型蘋果酒提供理論依據。以復合富硒蘋果汁為原料，在單因素基礎上利用Box-Behnken試驗對影響酒精度的主要釀造因子進行研究。結果表明：在此優化工藝條件下得到的酒精濃度為 12.3%，且糖度最低僅4 g·L-1，硒含量占0.075%，且該蘋果酒有機酸及單寧含量較高[11]。各因素發酵工藝的影響顯著性大小為：SO2用量>酵母菌添加量>發酵溫度。結合生產實際確定最適發酵條件為：酵母添加量0.3%，發酵溫度為25.0℃，SO2用量為100 mg·L-1；3種蘋果汁的最佳配比為4.5∶1.5∶2。