芽孢桿菌B16對厚垣普可尼亞菌ZK7產孢能力的影響

李雨鑫，孔垂旭，鄒順惺，劉亞君

(云南大學 省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650032)

根結線蟲(Meloidogynespp.)是一類專性內寄生于植物根系的生物[1]，其繁殖能力強，寄主廣泛，適應力強，是危害農作物的主要病原微生物之一。根結線蟲的防治方法主要有化學防治、物理防治、農業防治、生物防治、抗病育種等[2-3]，其中，生物防治具有安全、環境兼容性好等特點，是綠色農業發展的重要保障[4-7]。

厚垣普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)是一種寄生真菌，屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(叢梗孢目)(Moniliales)、絲孢科(叢梗孢科)(Monilaceae)、普可尼亞屬(Pochonia)[8]，菌絲可侵入到根結線蟲卵或者死去雌蟲留下的包囊中進行無性繁殖，產生分生孢子梗，從而導致根結線蟲死亡。厚垣普可尼亞菌可以產生一系列的酶類物質[9]，其中絲氨酸蛋白酶VCP1是降解根結線蟲卵卵黃層的主要酶[10]，使幾丁質層暴露[11]；胞外幾丁質酶能夠分解根結線蟲卵卵殼的幾丁質成分，從而導致根結線蟲死亡[12-13]。厚垣普可尼亞菌對根結線蟲具有很好的防治效果，是目前研究和開發生防菌劑的主要生防菌之一[14-16]。芽孢桿菌(Bacillussp.)是一類廣泛分布于植物根際的生防細菌，能產生抵抗逆境的芽孢，可在土壤中很好地定殖和繁殖[17-19]。芽孢桿菌分泌的堿性絲氨酸蛋白酶能夠分解根結線蟲的體壁，造成根結線蟲內容物的泄露，最終殺死根結線蟲。此外，芽孢桿菌的穩定性、與其它化學殺線蟲劑的相容性均優于其它生防真菌和非芽孢類生防桿菌[20-22]。

由于土壤生態系統的復雜性，特別是土壤的抑菌作用，單一菌劑的施用防治效果往往不穩定。前期研究發現，厚垣普可尼亞菌ZK7(簡稱ZK7)與芽孢桿菌BacillusnematocidaB16(簡稱B16)聯合使用能顯著提高ZK7對根結線蟲的防治效果；連續兩年的田間試驗結果也表明，根部厚垣普可尼亞菌數量提高了10%～40%，防效提升了30%～50%，根結線蟲的抑制率提高了40%～60%[23]。在此基礎上，作者研究B16對ZK7產孢能力的影響，并初步鑒定相關信號物質，為進一步揭示細菌提高生防真菌防治根結線蟲能力的機制奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料

供試菌株：B16、ZK7，均由云南大學省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室提供。

南方根結線蟲卵塊，分離自溫室盆栽番茄根結。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，滅菌水1 L，pH值6.0～7.0，121 ℃滅菌20 min。

PDB培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，滅菌水1 L，pH值6.0～7.0，121 ℃滅菌20 min。

NB培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，滅菌水1 L，pH值6.0～7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株發酵液的制備

B16發酵液的制備：用接種環接一環B16菌株于裝有200 mL NB培養基的500 mL三角瓶中，于37 ℃、170 r·min-1搖床培養36 h；取發酵液測定600 nm處吸光度(OD600)，當OD600值在1.8～2.0之間時，收集發酵液并分裝到50 mL滅菌離心管中，于4 ℃、8 500 r·min-1離心15 min；收集上清液，用0.22 μm細菌濾頭過濾除菌，4 ℃保存備用。

ZK7發酵液的制備：用接種刀切取1 cm×1 cm的經PDA平板活化后的ZK7菌塊于裝有250 mL PDB培養基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、170 r·min-1搖床培養72 h，使其孢子數達到106個·mL-1；將ZK7發酵液用6層滅菌的擦鏡紙過濾，除去菌絲體，用血球計數板統計孢子數，調整孢子數為104個·mL-1，4 ℃保存備用。

1.3 促產孢實驗

將B16發酵液與ZK7發酵液分別按1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10、1∶15、1∶20的比例混合，總體積40 mL；于28 ℃、170 r·min-1搖床共培養，每隔24 h用血球計數板統計孢子數。將NB培養基和ZK7發酵液按上述比例混合作為實驗對照，40 mL ZK7發酵液不做任何處理作為空白對照(CK)。處理組和對照組均做3個平行，實驗重復3次。

1.4 促產孢揮發性物質的檢測

(1)樣品的制備

B16培養液的制備：將B16菌株接種于裝有200 mL NB培養基的500 mL三角瓶中，于37 ℃、170 r·min-1搖床培養36 h,取5 mL培養液于15 mL頂空瓶中，加蓋密封。

ZK7培養液的制備：將ZK7菌株接種于裝有200 mL PDB培養基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、170 r·min-1搖床培養36 h，取5 mL培養液于15 mL頂空瓶中，加蓋密封。

共培養液的制備：將B16發酵液與ZK7發酵液按1∶7混合，于28 ℃、170 r·min-1搖床共培養36 h，取5 mL培養液于15 mL頂空瓶中，加蓋密封。

(2)固相微萃取

將SAAB-57318型75 μm CAR/PDMS 固相微萃取儀的萃取頭暴露于培養液上方約1.5 cm處；中速(攪拌時萃取頭不接觸到樣品)攪拌，65 ℃加熱，吸附萃取1 h；萃取結束后迅速將萃取頭縮回并拔出針頭，立即插入到氣相色譜氣化室的進樣口中，輕輕向下推出萃取頭，利用氣化室的高溫條件讓待測物解析1 min。

分析條件：Agilent 7890GC/5975MSD型氣質聯用儀，HP-5MS型色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，填料為5%苯基-95%甲基聚硅氧烷；載氣為氦氣(He)，流速1.0 mL·min-1；進樣口溫度250 ℃；柱溫：起始溫度50 ℃，保持2 min，以6 ℃·min-1升溫至180 ℃，再以8 ℃·min-1升溫至240 ℃，保持10 min；分流進樣，分流比10∶1；總運行時間40 min；質譜掃描范圍35～550 amu；離子源為EI源；電子能量70 eV。

1.5 促產孢揮發性物質的驗證

B16與ZK7共培養后產生了新的揮發性物質。選取2種含量較高的揮發性物質丁內酯、甲苯進行純品驗證，以進一步驗證這些揮發性物質是否與ZK7產孢量的增加有關。

將10 mL ZK7發酵液加入到裝有150 mL PDB培養基的300 mL三角燒瓶中，然后加入丁內酯/甲苯，使其濃度(以10 mL ZK7發酵液計，mg·mL-1)分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，以不加丁內酯/甲苯為空白對照，在28 ℃、170 r·min-1條件下分別搖床培養24 h、48 h、72 h，用血球計數板統計各處理組的孢子數。

2 結果與討論

2.1 B16對ZK7產孢量的影響(圖1)

注：C表示實驗對照，CK表示空白對照；對72 h數據進行單因素方差分析以及圖基多重比較，*表示P<0.05,**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，下圖同。

從圖1可以看出，B16發酵液與ZK7發酵液按1∶5、1∶7、1∶10比例混合時，B16對ZK7的產孢有一定促進作用，其中按1∶7比例混合共培養時對ZK7產孢量的影響最顯著。與空白對照相比，ZK7的產孢量最高提高了318.31%；在扣除NB培養基的影響后，產孢量最高提高了183.17%。

2.2 促產孢揮發性物質的檢測結果(表1)

從表1可以看出，B16單獨培養時產生的揮發性物質包括hexanal、2,5-dimethyl-pyrazine、2-heptanone、benzaldehyde、benzeneacetaldehyde、3-eicosene、(E)-benzeneacetaldehyde、2-nonanone、decanal、dodecanal、(Z)-9,17-octadecadienal、fluorene、(Z,Z)-9,12-octadecadienoic acid、2-hydroxy-cyclopentadecanone、heptadecane、dibutyl phthalate；ZK7單獨培養時產生的揮發性物質包括acetic acid、hexanal、2-amino-6-methylbenzoic acid、benzaldehyde、1,3-dimethoxy-benzene、(Z)-9,17-octadecadienal；B16與ZK7共培養時產生的新揮發性物質包括pentane、piperazine、3-aminopyrrolidine、trichloromethane、(E)-2-pentenal、3-hydroxy-2-butanone、toluene、butyrolactone、1-ethynyl-4-methyl-benzene、1-methyl-4-piperidinemethanol、benzocycloheptatriene、2-octyl-cyclopropaneoctanal。

表1 B16、ZK7單獨培養及共培養時產生的揮發性物質

2.3 促產孢揮發性物質的驗證結果(圖2)

從圖2a可以看出，加入不同濃度的丁內酯，ZK7的產孢量均比空白對照高；并且隨著丁內酯濃度的增加，ZK7的產孢量逐漸升高，當加入1.0 mg·mL-1丁內酯培養72 h時，ZK7的產孢量提高了262.00%。表明丁內酯能促進ZK7產孢。

從圖2b可以看出，加入不同濃度的甲苯，ZK7的產孢量均比空白對照低；并且隨著甲苯濃度的增加，ZK7的產孢量不斷降低，當加入1.0 mg·mL-1甲苯培養72 h時，ZK7的產孢量降低了74.62%。這說明甲苯不能促進ZK7產孢，而且過多的甲苯對ZK7產孢具有抑制作用。

圖2 丁內酯(a)和甲苯(b)對ZK7產孢量的影響

2.4 討論

Kerry[24]認為衡量一株生防真菌生防潛質的重要標準包括：菌株的產孢能力、對根結線蟲卵的侵染能力以及菌株的定殖能力(包括根際土壤及植物根內的定殖量)。從B16對ZK7的關鍵生防因子的測試可知，B16能促進ZK7分生孢子的產生。產孢能力的提高，有利于ZK7在土壤中能更好地定殖，從而增加ZK7侵染根結線蟲卵幾率，提高ZK7對根結線蟲的生物防治效果。厚垣普可尼亞菌的一個優勢在于分生孢子能抵御外界環境的不良影響，具有繁殖能力，芽孢桿菌可以促進厚垣普可尼亞菌產孢，提高分生孢子的產量，促產孢應該只是芽孢桿菌提高厚垣普可尼亞菌防治效率的因素之一。

與單獨培養相比，混合共培養時，B16發酵液與ZK7發酵液的最佳比例為1∶7，排除培養基的影響后，能使ZK7的產孢量最高提高183.17%。B16與ZK7共培養后產生了新的揮發性物質，其中丁內酯被證明與曲霉分生孢子的產生有關。Schimmel等[25]研究了丁內酯對曲霉分生孢子的影響，發現500 μmol·L-1的丁內酯能使曲霉的產孢量提高3倍。本研究結果表明，丁內酯對ZK7的產孢能力具有促進作用，產孢量隨著丁內酯濃度的增加逐漸升高，而甲苯對ZK7的產孢能力沒有促進作用。

3 結論

研究了芽孢桿菌B16對根結線蟲生防真菌厚垣普可尼亞菌ZK7產孢能力的影響，發現芽孢桿菌B16能顯著提高厚垣普可尼亞菌ZK7的產孢量；芽孢桿菌B16發酵液與厚垣普可尼亞菌ZK7發酵液共培養產生的丁內酯能促進ZK7產孢，產生的甲苯對厚垣普可尼亞菌ZK7的產孢能力沒有促進作用。芽孢桿菌B16與厚垣普可尼亞菌ZK7聯合進行生物防治可應對土壤環境的多樣性，其防治效果比單一菌劑有所提高。