自噬相關(guān)蛋白Atg5和Beclin-1在宮頸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理的相關(guān)性

薛小芳 岳會珠 何涯麗

宮頸癌是當(dāng)前婦科中最常見的1種惡性腫瘤，發(fā)病率為世界的第二位。30～35歲發(fā)病率最高，而50～55歲浸潤性癌的發(fā)病率最高[1]。早期宮頸癌患者治療效果比較好，而且5年生存率比較高，但是對于晚期宮頸癌患者來說，由于化療敏感性差，所以降低了患者的生存率。因此，需要更多分子生物學(xué)指標(biāo)來判斷宮頸癌患者對不同治療的反應(yīng)及惡性程度。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的大量降解系統(tǒng)，起著各種生理作用，如發(fā)育、分化和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。自噬功能障礙與嚴(yán)重疾病有關(guān)，包括肌病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥。這個(gè)多步驟的過程是由一組進(jìn)化上保守的稱為自噬相關(guān)蛋白(Atg)的蛋白質(zhì)來完成的[2]。Beclin-1是酵母Atg6的哺乳動物同源體，是自噬的關(guān)鍵介質(zhì)。它與調(diào)節(jié)自噬的多種共因子相互作用，其功能障礙與許多疾病有關(guān)，包括許多類型的人類癌癥。自噬的誘導(dǎo)是由稱為自噬體的雙膜結(jié)構(gòu)的形成開始的。自噬體包裹著細(xì)胞器和微生物等物質(zhì)，并與降解這些物質(zhì)的溶酶體融合。形成自噬體包括一個(gè)泛素樣的共軛系統(tǒng)，其中Atg5與Atg12共價(jià)結(jié)合。Atg5是共價(jià)修飾系統(tǒng)所必需的，對自噬的發(fā)生至關(guān)重要。最近的證據(jù)表明，自噬可能在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[3-4]。因此本文選取我院2017年6月至2020年6月共收治的60例宮頸癌患者作為研究對象，探討自噬相關(guān)基因5(Atg5)及Beclin-1兩種蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理的相關(guān)性，具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年6月至2020年6月共收治的60例宮頸癌患者作為研究對象，將其分為惡性組。入選標(biāo)準(zhǔn)：所有患者經(jīng)過病理學(xué)檢查確診為宮頸癌；在術(shù)前未經(jīng)免疫治療、化療以及放療等；無手術(shù)禁忌癥，具備手術(shù)指征；所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴(yán)重臟器功能障礙的患者；不能配合隨訪的患者；合并其他惡性腫瘤的患者。其中惡性組患者年齡41～68歲，平均年齡(56.22±3.51)歲；平均病程(12.22±1.24)個(gè)月。取同期60例良性子宮肌瘤或子宮腺肌瘤行全子宮切除手術(shù)的患者作為良性組，另取同期60例健康者的子宮頸組織標(biāo)本進(jìn)行分析，將其分為對照組。其中良性組患者中年齡45～69歲，平均年齡(55.34±4.55)歲；平均病程(12.44±1.35)個(gè)月。對照組患者年齡42～70歲，平均年齡(54.45±3.61)三組患者一般資料對比無顯著差異(P>0.05)。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)法：將收集的標(biāo)本在冰上進(jìn)行石蠟包埋，注意盡量將所有組織覆蓋，然后放入-20 ℃冰箱20～30 min，設(shè)置切片機(jī)3 μm，連續(xù)切片，認(rèn)真選取形態(tài)較好、組織完整的切片放到35 ℃溫水中，等到切片完全展平后收于防脫載玻片上，晾干后置于玻片架上，放入烤箱，調(diào)節(jié)烤箱溫度為65 ℃，烘烤2 h。

總RNA提取：從零下80 ℃的冰箱中取出不同類型的宮頸癌組織，將100 mg組織放入研缽之中加入氮液研磨，最后磨成粉末，加入BufferRLT1 ml進(jìn)行反復(fù)的吹打，讓樣品能夠充分的裂解，并在室溫5 min等待核酸蛋白復(fù)合物分離，之后按照說明嚴(yán)格步驟提取RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

免疫組化結(jié)果判定：應(yīng)用半定量計(jì)分法，細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，判定為陽性。并依照切片之中細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞總數(shù)分析。其中陽性著色重度為3分，中度為2分，輕度為1分，背景清晰無色為0分。陽性細(xì)胞數(shù)量>75%為3分，25%～75%為2分，<25%為1分。總分計(jì)3～6分為陽性[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三組患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA的表達(dá)情況對比分析

三組患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA表達(dá)情況對比差異顯著，惡性組明顯低于良性組和對照組(P<0.05)，如表1所示。

表1 三組患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA的表達(dá)情況對比分析

2.2 三組患者Atg5和Beclin1蛋白表達(dá)陽性率對比分析

三組患者Atg5陽性與陰性患者例數(shù)對比差異顯著(P<0.05)，Beclin1陽性與陰性患者例數(shù)對比差異顯著(P<0.05)，如表2所示。

表2 三組患者Atg5和Beclin1蛋白表達(dá)陽性率對比分析(例，%)

2.3 60例宮頸癌患者Atg5和Beclin1陽性與陰性患者臨床病理特征對比分析

60例宮頸癌患者中，Atg5陽性與Atg5陰性患者月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小對比無明顯差異(P>0.05)，兩組患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度對比差異顯著(P<0.05)，Beclin1陽性與Beclin1陰性患者月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小對比無明顯差異(P>0.05)，兩組患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度對比差異顯著(P<0.05)，如表3所示。

表3 60例宮頸癌患者Atg5和Beclin1陽性與陰性患者臨床病理特征對比分析/例

2.4 自噬相關(guān)基因Atg5和Beclin1與宮頸癌病理相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析顯示，月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小與自噬相關(guān)基因Beclin1和Atg5不相關(guān)(P>0.05)，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分化程度與自噬相關(guān)基因Beclin1和Atg5呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，如表4所示。

表4 自噬相關(guān)基因Atg5和Beclin1與宮頸癌病理相關(guān)性分析

3 討論

自噬屬于1種細(xì)胞維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的手段，一旦人體內(nèi)自噬功能出現(xiàn)異常，可以導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)異常增生情況，嚴(yán)重者會出現(xiàn)癌變現(xiàn)象。因此深入了解細(xì)胞的自噬功能與腫瘤細(xì)胞的自噬功能，能夠判斷腫瘤患者的預(yù)后情況，并研究出針對于腫瘤治療的有效藥物[6]。Beclin1又稱BECN1基因，屬于自噬啟動的關(guān)鍵蛋白，其主要作用于細(xì)胞自噬成核時(shí)期。相關(guān)研究表明[7-8]，Beclin1表達(dá)在人類的卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌之中分別下降了75%、50%和40%。Atg5位于人體染色體q21，編碼276個(gè)氨基酸，在自噬相關(guān)基因Atg嚴(yán)格調(diào)控自噬的過程中起到關(guān)鍵作用，At95首先與At912結(jié)合，形成的At95．At912泛素樣連接系統(tǒng)連接到外膜，自噬體膜延伸，進(jìn)而形成自噬體，在巨噬細(xì)胞中因缺少At95而導(dǎo)致吞噬體不能與溶酶體相互融合。相關(guān)研究表明[9]，Atg5與很多腫瘤的發(fā)展與發(fā)生存在關(guān)系，在卵巢癌、結(jié)腸癌和胃癌組織中Atg5基因的蛋白表達(dá)情況降低。

本研究結(jié)果顯示，三組患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA表達(dá)情況對比差異顯著，惡性組明顯低于良性組和對照組(P<0.05)，由此可以發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者的Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA表達(dá)情況降低，因此可以說明Atg5及Beclin-1 可能參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。相關(guān)研究表明[10]，Beclin1在膀胱癌組織之中的表達(dá)量明顯低于正常膀胱組織，而且在膀胱癌的發(fā)展與發(fā)生過程中具有重要作用。還有研究表明[11]，Atg5低表達(dá)患者3年生存率明顯更低，與本研究具有相關(guān)性；三組患者Atg5陽性與陰性患者人數(shù)對比差異顯著(P<0.05)，Beclin1陽性與陰性患者人數(shù)對比差異顯著(P<0.05)，由此證明，Atg5 和Beclin1在宮頸癌患者的陽性表達(dá)患者少于良性腫瘤組織和健康者，Atg5 和Beclin1的表達(dá)水平也就越低。由此可推測，Beclin1在宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生病變開始，會出現(xiàn)功能缺陷，這可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的其他抑癌基因出現(xiàn)相互作用，從而導(dǎo)致Beclin1表達(dá)出現(xiàn)異常，對細(xì)胞的自噬功能產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致其細(xì)胞惡性開始增殖，具體生物學(xué)通路還需要更多的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[12]；60例宮頸癌患者中，Atg5陽性與Atg5陰性患者月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小對比無明顯差異(P>0.05)，兩組患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度對比差異顯著(P<0.05)，Beclin1陽性與Beclin1陰性患者月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小對比無明顯差異(P>0.05)，兩組患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度對比差異顯著(P<0.05)；Spearman相關(guān)分析顯示，月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小與自噬相關(guān)基因Beclin1和Atg5不相關(guān)(P>0.05)，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分化程度與自噬相關(guān)基因Beclin1和Atg5呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分化程度是體現(xiàn)腫瘤惡性程度的臨床病理指標(biāo)，對于宮頸癌患者具有重要的預(yù)測作用，因此本文以這三個(gè)指標(biāo)來分析Beclin1和Atg5與病理的相關(guān)性。相關(guān)研究者對上皮性卵巢癌組織中Beclin1表達(dá)及相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與其明顯相關(guān)[13]。還有研究者發(fā)現(xiàn)[14-15]，Atg5在宮頸癌患者中呈現(xiàn)高表達(dá)，屬于宮頸癌的預(yù)后獨(dú)立因素，但是。一些自噬標(biāo)記物在人類癌中的表達(dá)改變已經(jīng)被報(bào)道，似乎表達(dá)減少和過度表達(dá)都可能發(fā)生。雖然，對單獨(dú)Beclin1和Atg5在癌癥中的表達(dá)研究比較多，但是對兩者一起的研究甚少，但是可能本研究中病例數(shù)過少，還存在一定局限性，所以還需后續(xù)更深入的研究。

綜上所述，自噬相關(guān)基因5(Atg5)及Beclin-1兩種蛋白在宮頸癌患者的癌組織中表達(dá)低于良性腫瘤患者和健康人士，隨著患者病情加重，自噬相關(guān)基因5(Atg5)及Beclin-1兩種蛋白表達(dá)明顯降低，自噬相關(guān)基因5(Atg5)及Beclin-1與宮頸癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分化程度呈負(fù)相關(guān)，因此可以應(yīng)用自噬相關(guān)基因5(Atg5)及Beclin1來判斷宮頸癌患者病情的嚴(yán)重程度。