雙靶點抗阿爾茲海默癥藥物的設計、合成與體外抑制活性

陳 丹，許 莉，秦 飛，祝珊珊，羅聯忠*

(1.廈門醫學院藥學系，福建 廈門 361023；2.廈門醫學院 廈門市海洋藥用天然產物資源重點實驗室，福建 廈門 361023；3.廈門醫學院 海洋生物醫藥資源福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023)

阿爾茲海默癥(AD)是一種多因素的復雜疾病，其具體發生機制尚不明確，目前針對AD的治療措施很有可能是基于錯誤的病理學機制。在早期，基于膽堿能假說開發了幾種以乙酰膽堿酯酶(AChE)為靶點的化合物來提高腦中乙酰膽堿(ACh)水平，如他克林[1]、多奈培齊[2]、利伐替明[3]、加蘭他敏[4]等，但這些藥物只能緩解疾病癥狀，之后開發的谷氨酸鹽保護劑美金剛[5]也只能單純緩解疾病癥狀。從上市藥物的作用機制來看，它們只與乙酰膽堿酯酶的中心催化位點相互作用。加利福尼亞電鰩乙酰膽堿酯酶(TcAChE)的晶體結構顯示其活性位點位于一個又深又窄的峽谷(20 ?)底部，該峽谷被稱為“活性位點峽谷”或“芳香峽谷”[6]。在活性位點，催化三聯體負責水解乙酰膽堿中的酯鍵；保守殘基Trp279是第二結合位點的主要組成部分，被稱為外周“陰離子”位點(PAS)，由Tyr70、Asp72、Tyr121、Trp279和Tyr334氨基酸殘基組成，距離峽谷頂部附近的活性位點14 ?[7]。大量研究證明，乙酰膽堿酯酶是β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)[8]聚集積累過程中最重要的分子伴侶，它可以加速β-淀粉樣蛋白的聚集，誘導β-淀粉樣蛋白的積累，并與之結合形成穩定復合物，從而增強其神經毒性。也有研究表明，暴露在乙酰膽堿酯酶表面的關鍵殘基Trp279導致β-淀粉樣蛋白聚集[9]。還有研究證實了多靶點配體(MTDL)在癡呆動物模型中的有效性[10-12]，為AD治療提供了新的方向。

近年來，有許多抗AD藥物以及對AD具有潛在治療效果的藥物，在經過臨床試驗后因種種原因先后被放棄，如在Ⅲ期臨床試驗中失敗的γ-分泌酶抑制劑Semagacestat(LY450139)[13]、γ-分泌酶抑制劑(R)-氟比洛芬、不可逆性膽堿酯酶抑制劑甲硝唑、膽堿酯酶和NMDA受體拮抗劑拉地吡啶等。越來越多的研究人員認為，AD是由多病原引起的疾病，因此尋找多靶點藥物成為新的研究趨勢[6]。常見的靶點有乙酰膽堿酯酶、β-淀粉樣蛋白、Tau蛋白等。因此，發現和開發有效的同時與中心催化位點和外周活性位點相互作用的多靶點抗AD藥物是目前研究者關注的焦點。

1 實驗

1.1 基于先導化合物的虛擬篩選

傳統中草藥駱駝蒿(PeganumnigrllastrumBunge)是蒺藜科駱駝蓬屬植物，其全株可入藥，有清熱、消炎、祛濕、殺蟲的作用。駱駝蒿的枝葉和種子含有多種生物堿，可治療風濕痹痛、無名腫毒。現代藥理研究證明，駱駝蒿生物堿具有降血糖[14]和抗癌作用[15]。從駱駝蒿的甲醇提取物中分離到多種生物堿，包括脫氧鴨嘴花堿酮，其體外生物實驗顯示其對乙酰膽堿酯酶有輕微的抑制作用[16]。因此，作者以脫氧鴨嘴花堿酮(圖1)為先導化合物，設計并合成脫氧鴨嘴花堿酮衍生物，通過測定其半數最大抑制濃度(IC50)來評價其體外抑制活性。

利用MOE研究脫氧鴨嘴花堿酮與乙酰膽堿酯酶的結合模式，篩選設計了一系列不同取代基的脫氧鴨嘴花堿酮衍生物Ⅰ1～Ⅰ4、Ⅱ1～Ⅱ4(圖2)。衍生物的ASE評分(MOE中可靠的評分函數)越低，相互作用力越強；IC50值越低，抑制作用越強。

圖2 虛擬篩選的脫氧鴨嘴花堿酮衍生物的結構式

1.1.1 酶蛋白的處理

由于人乙酰膽堿酯酶(hAChE)與TcAChE具有高度的序列同一性，所以選擇從Protein Data Bank20中獲得的TcAChE與加蘭他敏衍生物(1W6R)的復合物的晶體結構作為受體蛋白分子對接的側鏈開口構象，從蛋白質數據庫下載的蛋白質PDB編號為1QTI[17]。

具體操作步驟及參數設置如下：除去復合物中的配體和水分子，添加氫原子(All)、AMBER7 FF99電荷；活性口袋定義為與加蘭他敏中任一原子的距離在1.0 nm范圍內的所有氨基酸殘基；用MOL2格式輸出用于Gold計算。

1.1.2 配體小分子的處理

首先構建目標小分子，修正配體分子中原子和鍵的類型，添加氫原子，并對小分子配體進行能量優化，添加氫原子和Gasteiger-Marsili[18]電荷。然后運用Tripos[19]力場對小分子進行1 000步的分子力學優化，迭代算法為Powell，迭代終止條件為能量梯度0.005 kca1·mo1-1·A-1，非鍵相互作用截斷值為10.0，介電常數為78.0，以MOL2格式保存。

1.1.3 分子對接的參數設置

將得到對接口袋片段的蛋白質作為分子對接的靶標，將以TcAChE復合物中的小分子配體為中心、10 ?半徑空間內的所有氨基酸殘基片段定義為活性口袋。對接采用默認的GA設置，設置配體柔性的選項，限制原子和鍵的浮動，每個配體分子對接500個循環。

1.2 脫氧鴨嘴花堿酮衍生物的合成

1.2.1 試劑與儀器

鄰苯二甲酰亞胺、氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、無水冰醋酸、4-氨基丁酸、二碳酸二叔丁酯、碳酸氫鉀、四氫呋喃、正丁醇、茚三酮、乙酸乙酯、檸檬酸、無水硫酸鎂、2-吡咯烷酮、三氯氧磷、二氯甲烷、己內酰胺、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、2-氨基-4-氯苯甲酸、戊二醛、無水醋酸鈉、3A分子篩、對二甲胺基苯甲醛、環己烷、正己烷、三氯甲烷、柱層析硅膠，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

DHJF-2005型低溫反應釜，鄭州長盛實驗儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ) 型循環水式多用真空泵，鞏義予華儀器有限責任公司；C-MAG HS 7型磁力攪拌器、RV10 digital型數顯旋轉蒸發儀、HB10 digital型恒溫水浴鍋，IKA；101型電熱鼓風干燥箱，中興儀器設備有限公司；XMTD-8222型真空干燥箱，精宏儀器設備有限公司；ZF-2型三用紫外儀，上海安亭電子儀器廠。

1.2.2 合成方法

在三氯氧磷的存在下合成脫氧鴨嘴花堿酮衍生物Ⅰ1～Ⅰ4，三氯氧磷由于其良好的脫水性能，捕獲了縮合反應產生的水分子。通過衍生物Ⅰ1～Ⅰ4與對二甲胺基苯甲醛[20]的親核加成反應合成衍生物Ⅱ1～Ⅱ4。反應機理類似于醛縮合反應，氮原子附近碳原子上的氫被亞氨基活化，形成碳負離子作為親核試劑攻擊對二甲胺基苯甲醛，最終產物產率較高。合成路線如圖3所示。

圖3 脫氧鴨嘴花堿酮衍生物的合成路線

1.2.2.1 2,3-二氫吡咯并[2,1-b]喹唑啉-9(1H)-酮(Ⅰ1)的合成

將1.37 g(10 mmol)鄰氨基苯甲酸(參照文獻[21]合成，下同)、1.14 mL(11 mmol)2-吡咯烷酮和6 mL三氯氧磷依次加入到100 mL帶攪拌器的圓底燒瓶中，100 ℃無水條件下回流1 h；自然冷卻后，將反應物傾入碎冰中，用碳酸氫鉀溶液調節體系pH值至8，用100 mL二氯甲烷萃取3次，減壓旋蒸除去溶劑；以二氯甲烷為洗脫劑用柱層析色譜分離產物，得衍生物Ⅰ11.246 g，產率67%。

1.2.2.2 7,8,9,10-四氫氮雜并[2,1-b]喹唑啉-12(6H)-酮(Ⅰ2)的合成

將1.37 g(10 mmol)鄰氨基苯甲酸、1.695 g(15 mmol)己內酰胺和6 mL三氯氧磷依次加入到100 mL帶攪拌器的圓底燒瓶中，100 ℃無水條件下回流1 h；自然冷卻后，將反應物傾入碎冰中，用碳酸氫鉀溶液調節體系pH值至8，用100 mL二氯甲烷萃取3次，減壓旋蒸除去溶劑；以二氯甲烷為洗脫劑用柱層析色譜分離產物，得衍生物Ⅰ21.521 g，產率71%。

1.2.2.3 6-氯-2,3-二氫吡咯并[2,1-b]喹唑啉-9(1H)-酮(Ⅰ3)的合成

將1.73 g(10 mmol)2-氨基-4-氯苯甲酸、1.14 mL(11 mmol)2-吡咯烷酮和6 mL三氯氧磷依次加入到100 mL帶攪拌器的圓底燒瓶中，100 ℃無水條件下回流1 h；自然冷卻后，將反應物傾入碎冰中，用碳酸氫鉀溶液調節體系pH值至8，用100 mL二氯甲烷萃取3次，減壓旋蒸除去溶劑；用DMF/H2O混合溶劑重結晶，得衍生物Ⅰ31.652 g，產率75%。

1.2.2.4 3-氯-7,8,9,10-四氫氮雜并[2,1-b]喹唑啉-12(6H)-酮(Ⅰ4)的合成

將1.73 g(10 mmol)2-氨基-4-氯苯甲酸、1.695 g(15 mmol)己內酰胺和6 mL三氯氧磷依次加入到100 mL帶攪拌器的圓底燒瓶中，100 ℃無水條件下回流1 h；自然冷卻后，將反應物傾入碎冰中，用碳酸氫鉀溶液調節體系pH值至8，用100 mL二氯甲烷萃取3次，減壓旋蒸除去溶劑；以二氯甲烷為洗脫劑用柱層析色譜分離產物，得衍生物Ⅰ41.814 g，產率73%。

1.2.2.5 3-(4-(二甲胺基)亞芐基)-2,3-二氫吡咯并[2,1-b]喹唑啉-9(1H)-酮(Ⅱ1)的合成

將186 mg(1 mmol)衍生物Ⅰ1、195 mg (1.3 mmol)對二甲胺基苯甲醛、5顆活化的3A分子篩和5 mL無水冰醋酸依次加入到100 mL帶攪拌器的圓底燒瓶中，120 ℃無水條件下回流8 h；自然冷卻后，減壓旋蒸除去溶劑；用環己烷重結晶，得衍生物Ⅱ1146 mg，產率46%。

1.2.2.6 6-(4-(二甲胺基)亞芐基)-7,8,9,10-四氫氮雜并[2,1-b]喹唑啉-12(6H)-酮(Ⅱ2)的合成

將214 mg(1 mmol)衍生物Ⅰ2、195 mg(1.3 mmol)對二甲胺基苯甲醛、5顆活化的3A分子篩和5 mL無水冰醋酸依次加入到100 mL帶攪拌器的圓底燒瓶中，120 ℃無水條件下回流8 h；自然冷卻后，減壓旋蒸除去溶劑；用環己烷重結晶，得衍生物Ⅱ2177.1 mg，產率51%。

1.2.2.7 6-氯-3-(4-(二甲胺基)亞芐基)-2,3-二氫吡咯并[2,1-b]喹唑啉-9(1H)-酮(Ⅱ3)的合成

將221 mg(1 mmol)衍生物Ⅰ3、195 mg(1.3 mmol)對二甲胺基苯甲醛、5顆活化的3A分子篩和5 mL無水冰醋酸依次加入到100 mL帶攪拌器的圓底燒瓶中，120 ℃無水條件下回流8 h；自然冷卻后，減壓旋蒸除去溶劑；用環己烷重結晶，得衍生物Ⅱ3172 mg，產率49%。

1.2.2.8 3-氯-6-(4-(二甲胺基)亞芐基)-7,8,9,10-四氫氮雜并[2,1-b]喹唑啉-12(6H)-酮(Ⅱ4)的合成

將249 mg(1 mmol)衍生物Ⅰ4、195 mg(1.3 mmol)對二甲胺基苯甲醛、5顆活化的3A分子篩和5 mL無水冰醋酸依次加入到100 mL帶攪拌器的圓底燒瓶中，120 ℃無水條件下回流8 h；自然冷卻后，減壓旋蒸除去溶劑；用環己烷重結晶，得衍生物Ⅱ4206.5 mg，產率54%。

2 結果與討論

2.1 虛擬篩選結果

對接結果表明，苯基和氮原子是獲得既能與靶點中心催化位點又能與外周活性位點相互作用的化合物的關鍵。利用MOE設計了一系列不同取代基的脫氧鴨嘴花堿酮衍生物Ⅰ1～Ⅰ4、Ⅱ1～Ⅱ4。虛擬篩選結果顯示，所有衍生物的ASE評分(表1)均低于先導化合物脫氧鴨嘴花堿酮，特別是具有二甲胺基芐基取代的衍生物Ⅱ。ASE評分越低，相互作用越強。

表1 脫氧鴨嘴花堿酮衍生物的ASE評分

分子對接和相互作用分析結果顯示，所有衍生物都與TcAChE中的多活性位點相互作用。當衍生物Ⅱ4同時與酶中心催化位點和外周活性位點結合時，MOE對接結果最好。對接模型(圖4)表明，衍生物Ⅱ4的苯環D與Phe284的苯基通過經典的平行π-π積累相互作用，帶正電荷的氮原子與疏水位點Trp279的苯基通過陽離子-π效應相互作用，苯基穿過活性口袋底部的催化位置，通過π-π效應與Tyr70相互作用。相比之下，衍生物Ⅰ4的亞胺基氮原子通過水分子與Asp285和Ser286連接；此外，環A通過Trp279的苯基與酶的外周活性位點相互作用。顯然，具有二甲胺基芐基取代的衍生物Ⅱ與酶的結合優于沒有取代的衍生物Ⅰ。

衍生物Ⅰ4與TcAChE的對接模型 衍生物Ⅱ4與TcAChE的對接模型

2.2 脫氧鴨嘴花堿酮衍生物的表征

采用Bruker 500型傅立葉變換超導核磁共振儀對脫氧鴨嘴花堿酮衍生物Ⅰ1～Ⅰ4、Ⅱ1～Ⅱ4進行結構表征，結果如下：

衍生物Ⅰ1:1HNMR(CDCl3,500 Hz),δ:2.236～2.321(m,2H,CH2-CH2-CH2),3.140～3.199(m,2H,N=C-CH2-CH2),4.169～4.226(d,2H,CH2-CH2-N),7.302～7.727(m,3H,Ar-H),8.237～8.280(s,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅰ2:1HNMR(CDCl3,500 Hz),δ:2.197～2.258(m,6H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C),3.088～3.120(t,2H,N=C-CH2-CH2),4.109～4.138(t,2H,CH2-CH2-N),7.596～7. 633(s,3H, Ar-H),8.103～8.120(s,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅰ3:1HNMR(CDCl3,500 Hz),δ:1.734～1.824(m,2H,CH2-CH2-CH2),2.984～3.006(t,2H,N=C-CH2-CH2),4.308～4.325(t,2H,CH2-CH2-N),7.208～7. 373(d,1H,Cl-C=CH-CH),7.617～7. 935(s,1H,Cl-C=CH-C-N),8.166～8.184(s,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅰ4:1HNMR(CDCl3,500 Hz),δ:1.577～2.401(m,6H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C),3.116～3.148(t,2H,N=C-CH2-CH2),4.288～4.306(t,2H,CH2-CH2-N),7.289～7. 310(s,1H,Cl-C=CH-CH),7.515～7. 519(s,1H,Cl-C=CH-C-N),8.084～8.101(s,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅱ1:1HNMR(DMSO,500 Hz),δ:2.636～2.712(m,2H,CH2-CH2-C),3.036～3.060(s,6H,N-CH3),3.414～3. 4.31(t,2H,O=C-N-CH2-CH2),6.345(s,1H,C-C=C(H)-Ar-N),6.772～6.781(d,2H,H-o-Ar-N),7.457～7. 498(d,1H,HC=CH-CH),7.457～7.610(d,1H,CH=CH-C-N),7.629(d,2H,H-m-Ar-N),7.899～8.002(d,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅱ2:1HNMR(DMSO,500 Hz),δ:1.686～1.778(m,6H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-C),3.036～3.060(s,6H,N-CH3),4.321～4.344(t,2H,O=C-N-CH2-CH2),6.356(s,1H,C=C(H)-Ar-N),6.775～6.812(d,2H,H-o-Ar-N),7.457～7.498(d,1H,HC=CH-CH),7.457～7.610(d,1H,CH=CH-C-N),7.629(d,2H,H-m-Ar-N),7.899～8.002(d,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅱ3:1HNMR(DMSO,500 Hz),δ:2.633～2.708(m,2H,CH2-CH2-C),3.016～3.021(s,6H,N-CH3),4.282～4.315(s,2H,O=C-N-CH2-CH2),6.356(s,1H,C=C(H)-Ar-N),6.776～6.782(d,2H,H-o-Ar-N),7.521(d,1H,Cl-C=CH-CH),7.542(s,1H,Cl-C=CH-C-N),7.636(d,2H,H-m-Ar-N),7.939～8.005(d,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅱ4:1HNMR(DMSO,500 Hz),δ:1.722～1.856(m,6H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-C),3.006～3.022(s,6H,N-CH3),4.268～4.328(s,2H,O=C-N-CH2-CH2),6.356(s,1H,C=C(H)-Ar-N),6.742(d,2H,H-o-Ar-N),7.516(d,1H,Cl-C=CH-CH),7.534(s,1H,Cl-C=CH-C-N),7.629(d,2H,H-m-Ar-N),7.899～8.002(d,1H,O=C-C=CH)。

2.3 脫氧鴨嘴花堿酮衍生物對乙酰膽堿酯酶的體外抑制活性

以上市藥物加蘭他敏為陽性對照，采用埃爾曼方法[22]測定脫氧鴨嘴花堿酮衍生物對乙酰膽堿酯酶的體外抑制活性，結果見表2。

表2 脫氧鴨嘴花堿酮衍生物對乙酰膽堿酯酶的體外抑制活性

由表2可知，與陽性對照加蘭他敏相比，脫氧鴨嘴花堿酮衍生物對乙酰膽堿酯酶均表現出不同程度的體外抑制活性，且衍生物Ⅱ的體外抑制活性比相應衍生物Ⅰ的高；脫氧鴨嘴花堿酮衍生物對乙酰膽堿酯酶的體外抑制活性測定值與計算機輔助設計預測值基本一致；體外抑制活性最高的衍生物Ⅱ4的IC50值達到2.03 μmol· L-1，其體外抑制活性約為陽性對照加蘭他敏的2倍。

2.4 討論

對對接結果和體外抑制活性進行了分析和比較：

首先，由于對二甲胺基苯甲醛片段的取代，衍生物Ⅱ的體外預測和檢測數據均表現出比衍生物Ⅰ更強的抑制活性。這一發現在衍生物與加利福尼亞電鰩乙酰膽堿酯酶的對接模型中很明顯：衍生物Ⅱ4的苯環D通過經典的平行π-π積累與Phe284的苯基相互作用，帶正電荷的氮原子通過陽離子-π效應與疏水位點Trp279的苯基同時相互作用，苯基通過π-π效應與Tyr70相互作用。

其次，含氯取代基(R=Cl)的衍生物的體外抑制活性強于沒有取代基(R=H)的衍生物。這可能是由于：一是氯原子可能延長了分子的長度，使配體和受體之間的結合合理化；二是氯取代基的親電特性使其更容易與乙酰膽堿酯酶中的極性殘基相互作用。

最后，五元和七元雜環衍生物表現出不同的體外抑制活性，七元雜環衍生物具有較高的體外抑制活性，這可能是由于在對接時識別活性位點的偏差。從化學結構上看，七元雜環衍生物的平面結構比五元雜環衍生物的平面結構更好，可能使其與真實酶的結構匹配得更好。

3 結論

設計并合成了脫氧鴨嘴花堿酮衍生物，其IC50值在毫摩爾到微摩爾濃度范圍內，對乙酰膽堿酯酶有明顯的體外抑制活性；其中體外抑制活性最高的衍生物Ⅱ4的IC50值僅為2.03 μmol·L-1，其體外抑制活性約為陽性對照加蘭他敏的2倍，在治療AD方面具有潛力。ASE評分的高低與衍生物抑制活性的高低不完全一致，但總體上表現出一致的傾向。