2株臨床分離煙曲霉菌株病原學檢測及分子鑒定方法比較與分析*

杜偉勤，王淑峰，薛 婷

1.呂梁市人民醫院醫學檢驗科，山西呂梁 033000；2.山西醫科大學第一醫院醫學檢驗科，山西太原 030001；3.山西醫科大學第一醫院呼吸與危重癥醫學科，山西太原 030001

煙曲霉是曲霉菌屬中最常見一類機會致病性真菌，呈世界性分布，通過空氣傳播，可在免疫力低下患者中引起危及生命的侵襲性肺曲霉菌病(IPA)。唑類抗真菌藥物是臨床預防和治療IPA的首選藥物。近年研究發現，煙曲霉對唑類藥物的耐藥性日益嚴峻，且耐唑類藥物煙曲霉引起的IPA病死率高達100%[1]。然而，臨床上由于缺乏早期、快速、敏感和有效的煙曲霉檢測方法，IPA患者通常無法及時診斷，進而導致治療延誤。因此，本研究對臨床分離的煙曲霉菌株進行病原學檢測和分子生物學鑒定，并比較了不同檢測方法之間的差異，期望能夠輔助臨床提升診斷效率，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集山西醫科大學第一醫院臨床疑似肺曲霉菌感染患者痰液標本，經痰涂片、革蘭染色鏡檢，形態學初步鑒定為曲霉菌。

1.2主要試劑 亞甲藍染液 (珠海貝索生物技術有限公司)，六次甲基四胺、四硼酸鈉(遼寧永強醫藥器械化玻有限公司)，氯化金溶液(Sangon Biotech公司)，甜菜堿(Sigma公司)，Bst DNA聚合酶 (New England BioLabs)，100×羥基萘酚藍(HNB)溶液(北京百奧萊博科技有限公司)，E.coli DH5α感受態細胞，pMDTM18-T Vector Cloning試劑盒、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)、DNA Marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Tiangen公司)。

1.3方法

1.3.1涂片制備及培養 無菌棉簽挑取膿性痰液60～100 μL于干燥潔凈載玻片右側2/3處，均勻涂抹10 mm×20 mm左右卵圓形痰膜，自然干燥；迅速通過酒精燈外焰 3～4 次，加熱固定待用。接種環挑取膿性痰液2環，直接壓片法制備痰液涂片，待鏡檢。將適量痰液加入10 mL無菌生理鹽水的離心管中，劇烈振蕩15 s，3 500 r/min離心15 min，棄上清；重復上述步驟，接種環取沉淀分別接種于Sabouraud培養基和真菌顯色培養基，置于28 ℃培養箱中，每天觀察菌落生長情況。

1.3.2亞甲藍染色 亞甲藍溶液染色1 min，雙蒸水漂洗，自然干燥后，鏡檢。

1.3.3改良GMS染色 (1)冰甲醇固定；(2)過碘酸染色5 min，雙蒸水洗3 次，甩干；(3)載玻片置于加熱板上，GMS工作液覆蓋菌膜，加熱3～5 min (此過程中避免GMS工作液干涸)，直至涂片顏色變為深褐色，冷卻后雙蒸水洗3次，甩干；(4)滴加氯化金溶液，作用約15 s，菌膜顏色由深褐色變為灰白色，雙蒸水洗3次，甩干；(5)硫代硫酸鈉固定3 min，雙蒸水洗3次，晾干，鏡檢。

1.3.4提取煙曲霉DNA 分別取痰液2 mL，加入4倍體積生理鹽水洗滌，3 500 r/min 離心10 min，重復上述步驟3次，加入2 mL真菌細胞壁裂解液[100 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0，1.0% 十二烷基硫酸鈉(SDS)，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl]中，劇烈振蕩15 s，靜置5 min，加10 mg/mL蛋白酶K 10 μL，56 ℃ 6 h，酚-氯仿法提取DNA。

1.3.5PCR擴增 以1.3.4中提取的DNA為模板，所用引物見表1，分別進行PCR擴增，反應體系為25 μL(Premix Taq酶12.5 μL，10.0 mmol/L引物各1 μL，雙蒸水8.5 μL)，擴增條件為95 ℃變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環，72 ℃延伸8 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并回收。陽性對照為本實驗室保存的煙曲霉菌株，陰性對照為無菌雙蒸水。

表1 PCR擴增引物[2-4]

1.3.6TA克隆 采用Nanodrop分光光度計檢測膠回收DNA的濃度。10 μL反應體系：pMD18-T Vector 1 μL，DNA (10 ng) 1 μL，RNase-free Water 3 μL，Solusion 5 μL。然后于16 ℃放置過夜，第2天將其加入E.coli DH5α感受態細胞中，輕彈試管底部混勻，置于冰上靜置30 min；42 ℃水浴60 s，冰浴1～2 min后，加入890 μL LB 液體培養基中，37 ℃、225 r/min恒溫振蕩培養60 min；混勻后取100 μL，涂布于含1 μg/mL氨芐西林的LB固體培養基上，待菌液吸收完全，37 ℃恒溫培養箱過夜培養。菌落PCR鑒定所用引物為通用引物，擴增體系和條件同1.3.5。瓊脂糖凝膠回收后雙向測序。

1.4環介導等溫擴增(LAMP)擴增 以1.3.5中提取的DNA為模板進行LAMP擴增，所用引物見表2。25 μL反應體系如下：5 μmol/L F3/B3各1 μL，40 μmol/L FIP/BIP各1 μL，10 mmol/L dNTPs 3.5 μL，Betaine 2 μL，100 mmol/L Mg2+1 μL，Bst DNA 聚合酶1 μL，10×Thermo Pol Buffer 2.5 μL，DNA模板 2 μL，加Nuclease-free Water至25 μL。擴增條件為63 ℃ 1 h，擴增產物分別通過觀察白色沉淀，瓊脂糖凝膠電泳，可視化(在上述反應體系中加入25×HNB 1 μL)及real-time LAMP (在上述反應體系中加入10 μmol/L SYTO-9.0 0.5 μL)進行檢測。陽性對照為本實驗室保存的煙曲霉菌株，陰性對照為無菌雙蒸水。

表2 LAMP擴增所用引物[2]

2 結 果

2.1病原學檢測結果

2.1.1培養特性 2株煙曲霉在真菌顯色培養基培養，開始為白色菌落；培養3 d后，菌落邊緣呈白色，中心為藍綠色；培養8 d后，菌落呈深綠色。

2.1.2直接壓片法結果 痰涂片直接壓片結果可見典型呈45°分枝的鹿角樣曲霉菌菌絲。

2.1.3亞甲藍染色 痰涂片亞甲藍染色結果見圖1，可見煙曲霉子囊孢子和典型呈45°分枝的鹿角樣菌絲。

注：A為煙曲霉子囊孢子(×400)；B為鹿角樣菌絲(×400) 。

2.1.4改良GMS染色 改良GMS染色結果見圖2，可見煙曲霉培養物子囊孢子(圖2A)，痰涂片可見典型呈45°分枝的鹿角樣菌絲(圖2B)；圖2C和圖2D分別顯示煙曲霉培養物在油鏡和40倍鏡下的煙曲霉頂囊，呈燒瓶狀，可見分生孢子梗，偶見分枝。

注：A為煙曲霉子囊孢子(×400)；B為鹿角樣菌絲(×100)；C為煙曲霉頂囊(×1 000)；D為煙曲霉頂囊(×400)。

2.2分子鑒定結果

2.2.1TA克隆測序結果 本研究中分離的2株煙曲霉不同基因擴增測序結果分別與Genbank已公布序列經Blast分析結果顯示，rodA基因的同源性為100.00%；anxc4的基因測序結果顯示第30位存在T/C突變，其與Genbank已公布的煙曲霉anxc4同源性大于99.75%(其中C3與KU575847等同源性為100.00%，C4與KU575763的同源性為100.00%)。β-tub基因測序結果與Genbank已公布的煙曲霉β-tub基因同源性為100.00%(Genebank No.KU714964)；ITS基因測序結果與Genbank已公布的煙曲霉ITS基因同源性為100.00%(Genebank No.MT297633)；cyp51B基因測序結果與Genbank已公布的煙曲霉cyp51B基因同源性為100.00%(如MF070895)；cyp51A基因測序結果與Genbank已公布的煙曲霉cyp51A基因同源性為100.00%(如MT468488)。見表3。

表3 2兩株煙曲霉不同基因同源性分析結果

2.2.2LAMP檢測結果 LAMP擴增后，離心，可見陰性對照無白色沉淀，陽性對照與本研究所收集的標本可觀察到白色沉淀；LAMP反應體系中加入HNB溶液，恒溫擴增后，可視化檢測結果陰性對照為紫色，陽性對照與陽性標本為藍色；上述擴增產物于2%瓊脂糖凝膠進行瓊脂糖凝膠電泳，陽性對照與陽性標本為LAMP擴增典型梯度條帶，陰性對照無條帶；real-time LAMP擴增結果顯示，陰性對照無擴增，為一水平直線，陽性對照和陽性標本出現“S”型熒光擴增曲線，見圖3。白色沉淀、HNB可視化檢測結果、瓊脂糖凝膠電泳結果與real-time LAMP熒光擴增曲線結果一致，提示LAMP能準確快速鑒定疑似IPA患者呼吸道分泌物中煙曲霉基因。

注：A為白色沉淀；B為瓊脂糖凝膠電泳結果；C為real-time LAMP 檢測結果；M為DL 2 000 DNA Marker，1為陰性對照，2為陽性對照，3、4為陽性標本。

3 討 論

煙曲霉廣泛存在于自然界，是IPA最常見的一類機會性致病真菌[3-4]。近年來，隨著煙曲霉易感人群諸如惡性腫瘤、器官移植受者等免疫機能低下患者的增加，IPA發病率呈逐年上升趨勢，其病死率在50%以上[5-6]。快速、準確鑒定煙曲霉，對于嚴重感染者及時診斷、防治及改善預后至關重要。本研究對本院2例疑似IPA患者的痰液分別進行普通真菌培養、真菌顯色培養、直接壓片鏡檢、亞甲藍染色鏡檢、改良GMS染色鏡檢等病原學檢測，同時提取其DNA，應用rodA、anxc4、β-tub、ITS、cyp51A和cyp51B基因進行PCR、LAMP、TA克隆、分子鑒定，確定致病菌株為煙曲霉。盡管傳統的病原學培養方法檢測煙曲霉感染的金標準，但其耗時長，靈敏度低；真菌顯色培養菌落顏色雖出現白色-藍綠色-深綠色的轉變，但需要3～8 d隨時觀察菌落生長狀況，且不易與其他曲霉菌菌落形態顯色區分；直接壓片鏡檢、亞甲藍染色鏡檢雖可見煙曲霉子囊孢子和鹿角樣菌絲，但較難與其他曲霉菌形態區分，且鏡檢時菌絲易與黏液混淆；GMS染色法是檢測真菌感染常用的一種染色方法，本研究對傳統GMS染色方法進行了改良，縮短了染色時間，鏡檢可見煙曲霉特征性的頂囊結構，此方法也存在一定局限性，要求檢驗技術人員具備真菌形態學辨別與鑒定的豐富經驗。此外，真菌是實驗室常見的污染物之一，病原學檢測的特異性并不理想。

rodA、anxc4、β-tub和ITS基因都是曲霉菌分子鑒定中研究的熱門靶基因，cyp51A和cyp51B基因與煙曲霉對唑類藥物的耐藥性相關，也是常用于煙曲霉分子鑒定中的靶基因。本研究分別對臨床分離的2株煙曲霉的上述基因進行PCR擴增、TA克隆、鑒定、測序，序列分析結果顯示，其與Genbank已公布煙曲霉上述基因的同源性均大于99.7%，確定為煙曲霉菌株。PCR分子鑒定方法較傳統病原學方法更快速，且更靈敏，隨著PCR條件和核酸測定技術不斷成熟，其可能成為臨床實驗室檢測并鑒定絲狀真菌的一種技術。然而，PCR分子鑒定方法步驟較多，對臨床實驗室檢驗人員以及核酸的質量、純度、濃度要求較高，且在臨床標本的評估中存在較大局限性，阻礙了基于PCR技術在臨床實驗室應用的推廣和發展。盡管針對PCR擴增產物直接測序更加迅速，但為避免直接測序結果中存在某些突變位點是否由于PCR擴增本身所引起。本研究通過TA克隆后再進行測序，保證了測序結果的可靠性。此外，基因突變的原因復雜，遺傳因素、機體自身或是PCR擴增過程均可導致堿基的缺失、置換和插入等，且隨著Genbank數據庫中相似核苷酸序列的逐年更新，序列同源性比對的解讀、分析與鑒定更為困難。因此，以病原形態學檢測方法為基礎，進一步應用PCR的分子鑒定技術確定煙曲霉較可靠。

LAMP是2000年NOTOMI等[7]設計并建立的一種恒溫、快速、靈敏的分子生物學核酸擴增診斷技術，隨著該技術的不斷發展與完善，其廣泛應用于臨床傳染性和非傳染性疾病的分子診斷，預計其可替代PCR技術，并且對于將來實現全民健康覆蓋(UHC)具有十分重要的價值[8]。本研究以煙曲霉anxc4為目的基因，且選擇使用經驗證特異性強、檢測靈敏度高的LAMP擴增引物，通過將LAMP擴增技術與傳統煙曲霉病原學檢測方法和PCR技術進行比較，結果顯示其可在63 ℃ 1 h 內進行擴增，并同時對擴增產物進行檢測，表明其可快速、有效鑒別煙曲霉菌株。LAMP技術簡單、高效、快捷，其擴增效率高于PCR，能滿足低拷貝數標本的檢測[2,8]，且該方法對操作技術、儀器設備、標本處理的要求較低。其他實驗室檢測諸如血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中半乳糖甘露聚糖(GM)和1,3-β-D-葡聚糖檢測(G)的檢測，雖然對于IPA患者的診斷具有重要的臨床意義[9-11]，但僅有約50%的檢測結果與病原學檢測結果相匹配[12]，且特異性較差。此外，歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協作組(EORTC/MSG)對IPA診斷標準仍依賴于組織病理學和傳統病原學培養方法，然而在臨床實踐中，疑似IPA患者體質較弱，往往不耐受侵入性操作，不利于IPA患者的早期診斷。因此，LAMP技術適用于早期煙曲霉感染者的臨床實驗室鑒定。

綜上所述，傳統病原學鑒定煙曲霉的方法存在耗時長、靈敏度低等局限性，PCR和LAMP分子診斷技術較傳統方法反應迅速且靈敏度高，LAMP技術較PCR操作簡單。因此，LAMP技術更適用于臨床實驗室對IPA患者呼吸道分泌物中煙曲霉的早期鑒定，可輔助提升臨床IPA的診斷效率，為臨床治療提供依據。此外，進一步闡明煙曲霉結構、功能、耐藥性及耐藥機制對抗真菌藥物的設計與開發具有重要意義。