微流控技術在急診降鈣素原檢測中的應用*

金 寧，朱 馳，馬 俊

同濟大學附屬東方醫院檢驗科，上海 200120

降鈣素原(PCT)是診斷細菌感染的理想生物標志物[1],不僅可用于感染性和非感染性疾病的鑒別，而且在感染性疾病的早期診斷、病情評估和合理用藥方面均具有一定的指導意義[2]。目前對PCT定量測定的方法包括放射免疫分析法、免疫熒光法、雙抗體夾心免疫化學發光法、酶聯免疫吸附測定法(酶免法)等[3]，其中羅氏診斷生產的PCT檢測試劑盒(電化學發光法)在全自動電化學發光免疫檢測儀上實現了PCT檢測的自動化和快速化，干擾因素少，可滿足臨床檢測需求[4]。但是，羅氏電化學發光法要求標本必須來源于靜脈血，且通常為批量上機檢測，報告時間相對較長，不適合用于急診的即時檢測和兒科門急診的末梢血檢測[5]。因此，一種可利用末梢血檢測PCT的即時檢測技術的應用迫在眉睫。微流控技術是微尺度下的流體控制，其研究對象是微米級通道操控納升級以下微量液體的系統，而體外診斷是典型的流體操控過程，不僅需要操作便利，而且要求分析結果準確，因此，微流控芯片的應用是體外診斷技術發展和進步的重要途徑[6]。本文將PCT的新型微流控檢測技術與常規的羅氏電化學發光法比較，驗證微流控技術在PCT臨床檢測中的可行性，以期為臨床提供一種快速、準確、標本類型多樣的PCT即時檢測方法，從而降低急診檢驗的報告時間。

1 材料與方法

1.1標本來源 標本來源自2019年5月7-21日在本院進行PCT檢測的門診和住院部疑似細菌感染、有早期膿毒血癥癥狀的患者。

1.2標本采集 全血和血漿采集：采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝采血管采集靜脈血，離心分離后取血漿。血清的收集：采血后盡快以3 000 r/min離心10 min，分離血清。末梢血的采集：用一次性采血針穿刺無名指，將血液收集在0.5 mL EDTA-K2抗凝離心管中。在標本入組時排除重復檢測的病例標本，采用以上方法共收集140例患者的血漿標本，其中67份為與血漿標本來自同一患者的全血標本(同源全血)，69份為與血漿標本來自同一患者的血清標本(同源血清)，以及26份為與血漿標本來自同一患者的末梢血標本(同源末梢血)，合計302份標本。全部標本的檢測均在采集當天完成。

1.3方法 實驗方法：采用上海速創診斷產品有限公司生產的PCT測定試劑盒(免疫熒光法)及配套MI300型號干式熒光免疫分析儀。主要反應原理是將PCT熒光標記檢測抗體、PCT捕獲抗體和非特異性抗體分別固定在微流控檢測卡的通道內，待檢標本在通道內流動中分別完成與熒光標記的檢測抗體和捕獲抗體的反應，反應結束后通過短時離心去除廢液，讀取檢測反應區熒光信號自動擬合標準曲線算法后可得到標本中PCT的水平。對照方法：采用羅氏診斷生產的PCT檢測試劑盒(電化學發光法)及配套Cobas e411型電化學發光分析儀。采用雙抗體夾心二步法，待檢標本與生物素化的單克隆PCT抗體以及釕復合物標記的單克隆PCT抗體一起孵育，形成抗原抗體夾心復合物；加入包被鏈霉親和素的磁珠微粒進行孵育，復合體與磁珠通過生物素和鏈霉素的作用結合；通過電磁作用將磁珠吸附在電極表面，給電極加一定的電壓，使復合體化學發光，并通過光電倍增器測量發光強度，發光強度與PCT水平成正比。試驗方法與對照方法均嚴格按照說明書進行操作，實驗前各自進行校準和質控，以保證檢測結果的可靠性。

1.4統計學處理 相關性分析：對2種方法檢測結果及實驗方法中不同標本類型的檢測結果做相關分析和回歸分析，r≥0.975或r2≥0.95則可認為選擇的數據范圍適合，數據滿足要求。偏倚分析：采用Bland-Altman方法，以2種方法測定結果的均值作為X軸、差值為Y軸，計算所有差值的平均值(A)及標準差(SD)，并根據公式A±1.96SD得到覆蓋95%CI的一致性界限，根據一致性界限統計離群值和離群值比例。相對靈敏度、相對特異度和總體符合率：以對照方法檢測結果作為金標準，計算實驗方法檢測結果在醫學決定水平0.5 ng/mL和2.0 ng/mL的相對靈敏度和相對特異度，并應用 Kappa一致性檢驗判定兩種檢測方法的一致性。以Kappa值≥0.75表示一致性較好，0.40≤Kappa值<0.75 表示一致性一般，Kappa值<0.40表示一致性較差。

2 結 果

2.1相關性及偏倚分析 對照方法檢測血漿和實驗方法檢測血漿、同源全血、同源血清和同源末梢血結果兩兩比較，得到的一元回歸方程和線性相關系數r2見表1。通過分析，2種方法間及實驗方法不同標本類型間r2≥0.975，表明相關性較好。對照方法檢測血漿和實驗方法檢測血漿、同源全血、同源血清、同源末梢血結果的Bland-Altman分析顯示，對照方法檢測血漿與實驗方法檢測血漿、同源全血、同源血清、同源末梢血結果計算平均偏倚分別為-0.29、-0.21、-0.14、 -0.11 ng/mL，一致性界限為-3.30～2.71、-3.33～2.92、-1.07～0.80、-1.37～1.16 ng/mL，離群值比例分別為9/140、5/67、5/69、3/26。實驗方法血漿與同源全血、同源血清、同源末梢血結果計算平均偏倚分別為0.32、0、0.23 ng/mL；一致性界限為-1.60～2.23、-0.68～0.68、-1.48～1.94 ng/mL，離群值比例分別為4/67、4/69、2/26。結果顯示，對照方法與實驗方法間、實驗方法檢測不同標本類型間一致性較好，離群點個數占總體標本比例在合理范圍內。

表1 對照方法和實驗方法的一元回歸方程和線性相關系數

2.2一致性統計結果 以0.5 ng/mL和2.0 ng/mL為醫學決定水平進行統計分析，分別計算實驗方法相對于對照方法的相對靈敏度和相對特異度，結果見表2、3。結果顯示，實驗方法檢測血漿、同源全血、同源血清的相對靈敏度和相對特異度均較高，Kappa值均>0.75，實驗方法和對照方法一致性較好。

表2 以0.5 ng/mL為醫學決定水平的相對靈敏度、相對特異度和Kappa值

表3 以2.0 ng/mL為醫學決定水平的相對靈敏度、相對特異度和Kappa值

3 討 論

膿毒癥是機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙，其病情進展快、病死率高、后遺癥多發，早期診斷并及時治療可提高患者生存率以及改善預后[6]。PCT是臨床評估感染嚴重程度和膿毒癥的重要生物標志物，在嚴重細菌感染或膿毒癥時，PCT比其他炎性因子出現得早，且不受其他非炎癥指標干擾[7]，在臨床檢測中已廣泛應用，且效果較好[8]。PCT檢測方法較多，常用羅氏電化學發光法對標本PCT水平進行分析，這類檢測方法具有自動化程度高和檢測精密度高的特點，但標本類型要求為靜脈血，且處理及檢測耗時較長，不能夠滿足臨床快速獲取可靠檢測結果的需求[9]。在此背景下，采用末梢血全血進行PCT檢測備受關注[10]。與電化學發光法比較，微流控技術具有標本使用方便、標本消耗量少、出報告時間短等特點，適用于兒科和門、急診等即時檢測需求，可幫助臨床對感染性疾病進行快速診斷與鑒別診斷，極大地滿足臨床檢測要求。

本研究主要分析新型微流控技術檢測不同標本類型中PCT水平與羅氏電化學發光法檢測是否一致，并評估了微流控技術檢測不同標本類型中的PCT水平間的相關性和偏倚。羅氏電化學發光法檢測標本為血漿，而微流控技術除評估檢測血漿標本外，還分別收集了同源全血、同源血清和部分同源末梢血檢測。本研究結果表明，微流控技術檢測血漿、同源全血、同源血清和同源末梢血結果與羅氏電化學發光法檢測結果間的一元直線回歸方程相關性好，離群值在合理范圍內。以羅氏電化學發光法為金標準，計算微流控方法在0.5 ng/mL和2.0 ng/mL的醫學決定水平的符合率較高，Kappa一致性評判結果較好。因此，該微流控技術與羅氏電化學發光法一致性較好，符合臨床檢測需求。

本研究結果發現，微流控技術檢測血漿PCT與羅氏電化學發光法檢測結果具有較高的相關性，即在縮短了檢驗報告等待時間的同時，也滿足了臨床高精密度的要求。另外，血漿、全血、血清、末梢血等標本類型在應用于微流控技術檢測方法中的一致性較高，大大降低了臨床采集標本的要求；針對難以采集靜脈血的患者，微流控技術的末梢血模式可減輕該類患者的痛苦，減少報告時間，有利于臨床對感染性疾病的快速診斷，從而有效防止膿毒癥的發生、發展。PCT水平在臨床治療方面具有一定的指導作用。目前，國際上已基本確立了PCT指導抗菌藥物治療的具體流程[11]，當0.5 ng/mL

此外，微流控技術的應用有利于實現PCT的動態檢測，進一步指導臨床抗菌藥物的應用。膿毒癥與膿毒性休克處理國際指南中建議動態監測PCT水平，這有助于縮短膿毒癥患者抗菌藥物的使用療程，且對于初始懷疑膿毒癥、之后感染證據卻不足的患者，PCT水平可作為終止經驗性抗菌藥物使用的證據[12]。由此發現，PCT作為血清標志物，在指導膿毒癥的抗菌藥物治療方面有著重要作用。另外，動態監測血漿PCT水平的變化可準確反映感染的存在[13]，并使抗菌藥物療程明顯縮短，有利于改善病情和預后，避免抗菌藥物濫用，減少抗菌藥物耐藥及相關不良反應發生。動態監測PCT水平可通過評估病情，減少住院時間，降低醫療費用，從而減輕患者的經濟負擔。因此，微流控技術的末梢血檢測技術減少了患者靜脈采血頻次，減輕了患者動態監測PCT水平時的采血痛苦，為臨床動態監測PCT水平提供了可操作性及便捷性。

綜上所述，微流控技術不僅在早期快速診斷膿毒血癥方面具有明顯的效益，在臨床應用抗菌藥物治療方面的動態監測上也具有更高的可操作性及便捷性。總的來說，微流控技術是一種快速、準確、標本類型多樣化的即時檢測方法，可大大降低PCT急診檢驗的報告時間，減少患者靜脈采血的痛苦。然而，本研究也有一定的局限性，在分析微流控技術的靈敏度和特異度時，是以羅氏電化學發光法為金標準，未以患者是否為血流感染為金標準，具有一定的局限性；另外，本次標本量偏少，亟需擴大標本量的前瞻性研究進行驗證。