宮頸癌組織中長鏈非編碼RNA ZNF667-AS1的表達(dá)及臨床意義

胡 萃，劉 雙

湖南省婦幼保健院婦產(chǎn)科，湖南長沙 410008

宮頸癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，且呈年輕化發(fā)展，有研究顯示，宮頸癌患者術(shù)后仍存在較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1-2]。因此，尋找宮頸癌臨床診斷標(biāo)志物具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，其參與調(diào)控基因表達(dá)[3]。臨床研究顯示，lncRNA在宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤組織中呈異常表達(dá)[4-5]。ZNF667-AS1為新近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，其對腫瘤細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移有一定影響[6]。有文獻(xiàn)報道，鼻咽癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1的表達(dá)下調(diào)，其可能影響鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[7]。本課題組前期通過芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1表達(dá)異常。因此，本研究對比分析了宮頸癌組織、癌旁組織、正常宮頸組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1的表達(dá)，并探討其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2020年12月本院收治的80例宮頸癌患者納入研究，年齡39～71歲，平均(51.72±4.19)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)臨床病理檢查確診，且均為首次發(fā)病；(2)術(shù)前均未接受放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能異常者；(2)術(shù)前接受激素治療者；(3)合并嚴(yán)重感染性疾病者。另選取行全子宮切除術(shù)的80例子宮肌瘤患者作為對照，均經(jīng)臨床病理檢查確診，年齡36～72歲，平均(50.68±3.75)歲。宮頸癌患者與子宮肌瘤患者年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理學(xué)委員會審批，入組患者均對本研究知情同意，并簽訂知情同意書。

1.2儀器與試劑 LEPGEN-96實時熒光定量PCR儀由北京樂普醫(yī)療科技公司提供；紫外可見超微量分光光度計由南京菲勒公司提供；Trizol試劑盒購自杭州新景生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自上海聯(lián)邁生物公司；lncRNA ZNF667-AS1及內(nèi)參β-ACTIN引物委托上海生工生物公司合成。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本收集 收集宮頸癌患者術(shù)后癌組織及對應(yīng)癌旁組織(距癌組織邊緣≥2 cm)，收集子宮肌瘤患者術(shù)后正常宮頸組織，新鮮組織標(biāo)本經(jīng)液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱中待檢。

1.3.2lncRNA ZNF667-AS1檢測方法 總RNA提取：分別取50 mg宮頸癌組織、癌旁組織、正常宮頸組織標(biāo)本超聲勻漿，應(yīng)用Trizol試劑盒提取總RNA，經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后檢測RNA的完整性，RNA的純度和濃度應(yīng)用光度計檢測。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反應(yīng)體系20 μL，按照試劑盒說明書操作，總RNA 1 μL，RNA酶抑制劑0.19 μL，上、下游引物各3 μL，dNTPs 0.15 μL，MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μL，10×RT buffer 1.5 μL，加DEPC水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，90 ℃ 5 min，4 ℃ 1 min，產(chǎn)物置于4 ℃保存。lncRNA ZNF667-AS1上游引物為5′-GCTGGAAGCACAGAGATGAG-3′，下游引物為5′-CGTAGTAAGCGCCACGACTG-3′，β-Actin上游引物為5′-GCGGACTACTGGCTCACTAC-3′，下游引物為5′-ACTCATCTGTCTGCCTGATT-3′。PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系20 μL，按照試劑盒說明書操作，cDNA 1 μL，TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，雙蒸水7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

1.3.3結(jié)果計算 每組設(shè)3個復(fù)孔，分別計算各標(biāo)本平均循環(huán)閾值(Ct值)，根據(jù)公式2-ΔΔCt，計算lncRNA ZNF667-AS1的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1組織標(biāo)本中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1的相對表達(dá)量分析 宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1的相對表達(dá)量，明顯低于癌旁組織及正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=33.501、31.658，P<0.01)；癌旁組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1的相對表達(dá)量低于正常宮頸組織，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.689，P=0.931)，見圖1。

2.2不同臨床特征宮頸癌患者lncRNA ZNF667-AS1相對表達(dá)量比較 在不同F(xiàn)IGO分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1的相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床特征宮頸癌患者lncRNA ZNF667-AS1相對表達(dá)量比較

續(xù)表1 不同臨床特征宮頸癌患者lncRNA ZNF667-AS1相對表達(dá)量比較

2.3lncRNA ZNF667-AS1診斷宮頸癌的ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示，lncRNA ZNF667-AS1診斷宮頸癌的曲線下面積為0.834(95%CI：0.739～0.968)，診斷靈敏度為92.35%，特異度為81.12%。

3 討 論

隨著臨床研究的深入，lncRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等熱點問題受到臨床關(guān)注[8]。lncRNA與某些特定疾病密切相關(guān)，其在某些惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，或?qū)⒊蔀榕R床惡性腫瘤診療的潛在標(biāo)靶[9-10]。既往研究顯示，lncRNA LINC01503[11]、lncRNA NPPA-AS1[12]等lncRNA均與宮頸癌發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。ZNF667-AS1基因是ZNF667基因的反義鏈，位于19q13.43染色體上，其在結(jié)腸腺瘤、乳腺癌等多種腫瘤中存在表觀遺傳學(xué)沉默[13]。本課題組前期通過芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZNF667-AS1在宮頸癌組織中表達(dá)異常。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1的相對表達(dá)量明顯低于癌旁組織及正常宮頸組織，提示宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1的低表達(dá)可能與宮頸癌發(fā)病有關(guān)，lncRNA ZNF667-AS1可能發(fā)揮抑癌作用。鄭杰等[14]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)lncRNA ZNF667-AS1的表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲。吳璇等[15]研究報道，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1表達(dá)明顯降低，其表達(dá)水平與腫瘤組織TNM分期及分化程度有關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同F(xiàn)IGO分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1的相對表達(dá)量差異明顯，且FIGO分期越高、分化程度越低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1表達(dá)越低。因高FIGO分期、低分化是腫瘤惡性生物學(xué)行為的表現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是預(yù)后不良的指標(biāo)，故推測lncRNA ZNF667-AS1低表達(dá)可能是預(yù)測宮頸癌患者預(yù)后不良的潛在指標(biāo)。有學(xué)者研究報道，ZNF667-AS1在喉癌組織中表達(dá)下調(diào)，且其低表達(dá)與喉癌組織的病理分化程度相關(guān)，下調(diào)ZNF667-AS1的表達(dá)可增強(qiáng)AMC-HN-8和TU177細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力[16]。另有文獻(xiàn)報道，lncRNA ZNF667-AS1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，其可通過調(diào)節(jié)ANK2/JAK2的表達(dá)，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展[17]。由以上研究可知，lncRNA ZNF667-AS1與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZNF667-AS1診斷宮頸癌的曲線下面積為0.834(95%CI：0.739～0.968)，診斷的靈敏度為92.35%，特異度為81.12%。因此，推測lncRNA ZNF667-AS1可作為宮頸癌臨床診斷的生物標(biāo)志物。

綜上所述，宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF667-AS1呈低表達(dá)，其表達(dá)水平與FIGO分期呈負(fù)相關(guān)，可作為預(yù)測宮頸癌的生物學(xué)標(biāo)志物及潛在治療靶標(biāo)，但相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。