不同吸收細胞的選擇對Rh血型系統抗-G抗體綜合鑒定的影響*

蘇承丹，練栩輝，何 屹

1.成都市第八人民醫院檢驗科，四川成都 610036；2.大竹縣人民醫院輸血科，四川達州635100；3.四川省人民醫院輸血科，四川成都 610072

Rh血型系統是紅細胞血型系統中最具復雜性和多態性的血型系統[1]。Rh血型系統抗原屬同種異型，其抗原性強，截至2019年7月，國際輸血協會(ISBT)確認的Rh系統抗原達到55個，其中有5種主要抗原在臨床上有重要意義，即D、E、e、C、c抗原[2]。此外，G抗原也是Rh血型系統的一種多態性抗原，且C和(或)D抗原陽性的紅細胞幾乎同時含有G抗原，臨床上也已發現抗-G引起的輸血反應及新生兒溶血病。但由于抗-G一般表現為既抗-C又抗-D，很難與抗-C和抗-D分開，在Rh陰性患者產生的抗體中，常只重視抗-D，僅選擇RhD陰性的血液輸注，而抗-C常常被忽視，導致輸血反應的發生[3-4]。抗-G可以應用rG/dce或r/G/dce細胞經吸收/放散試驗分離出來，但這類紅細胞非常少見和難以得到[5]。抗-G在國內的報道不多，主要是由于G抗原的分子機制仍然不明，且Rh陰性個體在漢族人群中相對稀少[6]。在參考文獻[7]的基礎上，本研究選擇O型Rh表型為CCdee和ccDee的紅細胞來吸收該患者血清。抗-G抗體的鑒定理論上可以應用rG/dce 或r/G/dce 的紅細胞，通過吸收/放散方式鑒定，但因這類細胞非常少見，一般采用雙步放散試驗來分離[8-9]。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，女，65歲，因貧血入院。入院后診斷為重度貧血、骨髓異常綜合征。有輸血史，孕3產1,血型復查A型，RhD陰性，不規則抗體篩查陽性。

1.2儀器與試劑 主要試劑：抗-A、抗-B、抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e試劑均由上海血液生物醫藥有限公司提供，另外兩種抗-D試劑由北京金豪制藥股份有限公司和Dominion biologicals公司提供，ABO 試劑紅細胞由上海血液生物醫藥有限公司提供，抗體篩選細胞由江蘇力博公司提供，抗體鑒定譜細胞由Sanquin公司提供，酸放散試劑由江蘇力博公司提供。所有試劑均在有效期內使用。主要儀器：KA-2200久保田離心機，Grant JBN5水浴箱，Ortho Biovue system離心機、孵育器。

1.3方法 (1)ABO及Rh血型鑒定：使用Ortho Biovue卡式及鹽水試管法，使用3種不同來源的抗-D試劑進行患者和獻血者Rh陰性確認。(2)抗體篩查：使用Ortho Biovue卡式及鹽水試管法按照試劑說明書操作規范進行。在卡式反應腔中加入血清40 μL,3%～4%試劑紅細胞10 μL，低離子液50 μL，37 ℃孵育10 min后，在專用離心機離心5 min后觀察結果。(3)抗體鑒定：使用Ortho Biovue卡式試管法按照試劑說明書操作規范進行。(4)吸收試驗：吸收試驗分為A、B兩組，選用不同抗原表型紅細胞，與患者血清1∶1混勻，置于37 ℃吸收30 min，每10 min輕搖試管，吸收后1 000×g離心1 min后分離上清液和壓積紅細胞。將第1次吸收試驗的放散液作為第2次吸收試驗的待吸收液。抗原表型為CCdee吸收細胞來源于經血液中心Rh陰性確認的獻血者紅細胞，抗原表型為ccDee吸收細胞來源于血液中心獻血者紅細胞。A組第1次吸收試驗和第2次吸收試驗分別選用抗原表型為ccDee和CCdee的紅細胞，B組第1次和第2次吸收試驗分別選用抗原表型為CCdee和ccDee的紅細胞，對吸收后的放散液進行抗體鑒定。(5)放散試驗：采用酸放散，將吸收后紅細胞用生理鹽水洗滌3次,每次洗滌后，1 000×g離心1 min，最后1次的洗滌液留作陰性對照。按試劑說明書，將試劑溶液Ⅰ與試劑溶液Ⅱ按照1∶4體積比混合制備成洗脫液2 mL。在2 mL洗脫液中加入1 mL待放散的壓積紅細胞，混勻。室溫孵育1 min，加入0.1 mL試劑溶液Ⅲ，混勻，1 000×g離心1 min，分離得壓積紅細胞及上清液。將上清液移至另一干凈的試管中，滴加試劑溶液Ⅲ，以溶液顏色由紫色轉變為藍色為反應終點。1 000×g離心3 min，上清液即為可用于抗體檢測的放散液。

2 結 果

2.1血型及不規則抗體篩查結果 患者血型卡式法和鹽水試管法篩查結果均為A型、RhD陰性，卡式不規則抗體篩查和鹽水試管法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均為3+。

2.2抗體特異性鑒定結果 從16組譜細胞的反應情況可以推斷出可能為抗-C、抗-D抗體，對患者Rh血型系統進行分型，結果為ccdee。

2.3A、B兩組試驗對抗-C、抗-D和抗-G抗體的吸收放散結果 A組試驗第1次吸收試驗選用獻血者O型抗原表型為ccDee紅細胞,吸收后的上層清液和吸收后細胞放散液與4、5、9號譜細胞進行間接抗人球蛋白試驗(IAT)，見表1。上清液仍可與抗原表位含ccDee和CCdee譜細胞反應，說明上清液中仍殘存抗體，且類型無法確定，放散液與ccDee譜細胞反應，說明放散液中存在抗-D抗體，而放散液未與CCdee譜細胞反應，不符合抗-G抗體的特性，由此推斷未檢測出抗-G抗體，因此未進行第2次吸收放散試驗。B組試驗中，第1次吸收試驗和第2次吸收試驗分別選用抗原表型為CCdee和ccDee紅細胞,見表2。

表1 A組試驗結果

表2 B組試驗結果

3 討 論

G抗原為Rh 血型系統抗原， ISBT 中序號為Rh12，高加索人中表達頻率為84%，黑種人為92%，亞洲人群中幾乎為100%。RhD 和RhCE 的C 等位基因外顯子2 編碼的Ser103是G 抗原活性的關鍵，通常D 及C 陽性的紅細胞上都存在G 抗原，但也有極少D 或C 陽性的紅細胞沒有G 抗原的案例報道。G抗原由ALLEN 和TIPPETT[10]于1958 年在美國的獻血者中發現，該獻血者表型為ccdee卻可與抗-C、抗-D 反應，因紅細胞膜上沒有C 和D 抗原，但有G 抗原，能與抗-C、抗-D血清反應。從16組譜細胞反應情況推斷出患者血型含有5種可能：抗-D合并抗-C，抗-G，抗-D合并抗-G，抗-C合并抗-G，抗-D、抗-C和抗-G 3種抗體混合存在。由于抗-G 可與D 和(或) C抗原陽性的紅細胞反應，在臨床實踐中，易誤認為抗-D或抗-C[11]。若要準確知道抗體類型，需進行吸收放散試驗區分。

根據紅細胞不同的抗原表型，選用只存在C或D抗原的細胞進行吸收后放散，均可進行區分抗-C、抗-D和抗-G。但是實際上由于Rh表型上G抗原位點數與Rh分型存在關聯性，選用不同的細胞，吸收放散的結果截然不同。試驗結果可見，使用ccDee的細胞吸收放散后，不與CCdee的細胞凝集，只與ccDee細胞凝集，說明放出抗體只有抗-D特性，無抗-C特性，不能推斷出抗-G的存在。吸收后血清與ccDee、CCdee細胞凝集，只說明抗體有抗-D，抗-C特性。B組試驗可見先用CCdee的細胞吸收放散后，放散液與ccDee、CCdee的細胞發生凝集，在沒有抗-e的前提下，說明C抗原吸收的抗體同時帶有抗-D的特性，存在抗-G和(或)抗-C。再用ccDee對放散液吸收后放散，檢測出對ccDee和CCdee有凝集的抗體，進一步說明第1次吸收試驗用CCdee吸收的抗體同時帶有抗-C和抗-D的特性，血清中抗-C和抗-D是一個不能分離的整體，符合抗-G的特點。用ccDee的細胞吸收后血清不與CCdee反應，說明不含抗-C。本研究局限性在于未進行Rh陰性表型C抗原陽性的獻血者細胞基因分型，Rh陰性表型C抗原陽性的紅細胞大多有變異型弱D抗原表位，建議對Rh陰性表型C抗原陽性的譜細胞/獻血者細胞進行基因分型，排除弱D抗原存在的可能性。

從A、B組試驗看出，抗-G與C抗原反應強度大于D抗原[12]。SKOV[13]曾做過Rh表型上G抗原位點數,結果顯示，G抗原位點在DCe/DCe表型上為9 900～12 200個，dCe/dCe有8 200～9 700個，DCE /DCE有5 400個，DcE/DcE 有3 600～5 800個，Dce/Dce有4 500～5 300個，DcE/dce有4 200個。dCe/dCe 的G抗原量遠遠多于DcE/DcE。這也是A組使用ccDee細胞未能有效吸收抗-G的原因。多次吸收和放散試驗是在缺少稀有、特異性紅細胞時，鑒定抗-G的簡便實用方法[14]。但需要注意根據不同Rh表型紅細胞上的G抗原的位點數不同來選擇合適的吸收細胞進行吸收放散試驗來推斷抗-G，如dCe/dCe型。Rh陰性血型系統的不規則抗體約占48.84%，證實了臨床檢出的不規則抗體主要集中在Rh血型系統[15]。

此外，抗-G多與抗-D或抗-D、抗-C混合在一起，抗-G會封閉C和D位點，有時還會封閉e位點。這也是引起遲發性輸血反應和新生兒溶血病并導致交叉配血不合的原因[16-18]。Rh陰性患者出現抗篩陽性時，可能同時存在抗-D、抗-C、抗-G，需進行抗體鑒定。有研究表明，ccdee(57.18%)表型明顯多于Ccdee表型(30.25%)和CCdee表型(6.41%)[19]。RhD陰性血液的Rh分型可能為Ccdee，患者如果存在抗-G或抗-C，則不能輸注。因此，在臨床單獨常規檢測Rh血型系統RhD抗原是不能滿足臨床合理安全輸血要求的，需對Rh血型系統主要的5種抗原常規進行檢測，并給予Rh血型同型血液輸注，可有效避免因輸血而產生Rh同種抗體，減少輸血風險，這也是未來精準輸血的要求[20]。

抗-G抗體是一種兼有抗-D和抗-C兩種特異性的不規則抗體，不僅可以引起溶血性輸血反應，也會導致新生兒溶血病[21]。因此，對抗篩陽性的Rh陰性患者，應關注抗-G的問題，不同Rh表型紅細胞上G抗原的位點不同，在進行鑒定時，應優先選擇抗原位點更多的Rh表型為dCe/dCe的紅細胞作為吸收細胞，以保證試驗效果，確保輸血安全。