豬偽狂犬病病毒TK/gE/gI缺失株的構(gòu)建及與Montanide Gel 01佐劑聯(lián)合免疫效果評(píng)價(jià)

顏志斌，陳美靜，唐 棟，任小波，吳曉燕，紀(jì)秋云，劉家齊，何淑菲，琚春梅 (華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

偽狂犬病病毒(PRV)屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，水痘病毒屬[1]。PRV可引起妊娠母豬流產(chǎn)、成年豬的呼吸系統(tǒng)疾病及仔豬的神經(jīng)系統(tǒng)疾病甚至死亡[2-4]。自2011年以來(lái)，在接種了Bartha-K61疫苗的豬群中出現(xiàn)了偽狂犬病(PR)的暴發(fā)[5]。經(jīng)基因組測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)，本輪PR暴發(fā)是由新的變異毒株所引起[6]。同時(shí)有研究表明，Bartha-K61疫苗不能對(duì)新的PRV變異株提供完全有效的保護(hù)[7]。因此，迫切需要研發(fā)更有效的針對(duì)PRV變異株的疫苗以提高豬群的抵抗力。

TK基因是PRV的主要毒力基因，同時(shí)也是病毒增殖的非必需基因，缺失后不但可使病毒的毒力大大降低，而且對(duì)病毒的增殖特性影響很小[8]，因此可以通過(guò)缺失TK基因來(lái)制備PRV弱毒疫苗。同時(shí)，通過(guò)添加適當(dāng)?shù)淖魟梢允挂呙绲拿庖咝Ч@著提升。本試驗(yàn)選用的佐劑Montanide Gel 01(MG01)是一種聚合物佐劑，現(xiàn)有研究表明，牛皰疹病毒、大腸桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的疫苗與MG01聯(lián)合使用時(shí)，其免疫效果明顯增強(qiáng)[9-11]。

1 材料與方法

1.1 毒株與試劑PRV gE/gI雙基因缺失突變株rPRV-AH-gE-/gI-為前期研究中所構(gòu)建[12]。PRV流行毒株P(guān)RV-AH[13]、BHK-21細(xì)胞、EscherichiacoliDH5α、pEGFP-N1質(zhì)粒均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室保存。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、EcoRⅤ、PstⅠ、Hind Ⅲ及pMD18-T均購(gòu)自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent 購(gòu)自Invitrogen公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司；病毒DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司；……