p53、人半翼基因在宮頸癌前病變及宮頸癌中的表達及相關性分析

王博，吉婷，王林林，王敏

西北婦女兒童醫院產科，西安 710061

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤，發病率較高，且 呈年輕化趨勢。宮頸癌易出現侵襲、轉移，惡性程度較高，患者的預后較差，晚期生存率較低。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是導致宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）及宮頸癌的主要危險因素，宮頸上皮感染HPV后可通過多種生物學途徑改變細胞的生物學行為，導致細胞癌變。目前，HPV感染在宮頸癌發生發展中的具體機制尚有待進一步深入研究。HPV16/18型是引起宮頸癌最多的病毒類型，HPV16/18型E6蛋白在阻止細胞凋亡和分化、控制細胞形狀和信號轉導方面發揮重要作用，與宮頸癌發生發展密切相關。p53蛋白是機體重要的細胞生長負調節因子，在宮頸癌組織中表達上調，且對患者的預后有一定的預測價值。人半翼基因（human wings apart-like，hWAPL）是 果 蠅 體 內

WAPL

基因在人體內的同源序列，在其他腫瘤中表達下調，僅在宮頸癌組織中特異性高表達。基于此，本研究探討p53、hWAPL在宮頸癌前病變及宮頸癌中的表達及相關性分析，為臨床宮頸癌的預防及基因治療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2020年1月西北婦女兒童醫院收治的宮頸病變和宮頸癌患者。納入標準：①均經病理組織學檢查確診為CIN或宮頸癌；②年齡≥18歲；③病歷資料完整。排除標準：①既往接受過放療、化療；②接受宮頸物理治療或手術治療；③妊娠或哺乳期女性；④合并其他部位惡性腫瘤、重要器官嚴重損傷、自身免疫性疾病。依據納入和排除標準，本研究共納入67例低級別CIN患者（CINⅠ）、58例高級別CIN患者（CINⅡ～Ⅲ）、42例宮頸癌患者。CINⅠ患者年齡27～66歲，平均（45.86±8.06）歲；已婚56例，未婚11例；體重指數（body mass index，BMI）為 18.45～26.85 kg/m，平均（22.68±1.45）kg/m。CINⅡ～Ⅲ患者年齡23～69歲，平均（46.53±7.19）歲；已婚50例，未婚8例；BMI為19.38～25.19 kg/m，平均（22.51±1.64）kg/m。宮頸癌患者年齡21～63歲，平均（45.62±6.93）歲；已婚37例 ，未 婚 5 例 ；BMI為19.41～26.13 kg/m，平 均（22.30±1.85）kg/m。同期選取39例宮頸炎患者，年齡24～62歲，平均（46.29±7.53）歲；已婚33例，未婚 6例；BMI為 18.50～26.24 kg/m，平均（22.26±1.37）kg/m。四組患者年齡、婚姻狀況和BMI比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組化法檢測不同組織中HPV16/18型E 6、 p53、hWAPL蛋白的表達情況

取125例CIN患者的CIN組織、42例宮頸癌患者的宮頸癌組織、39例宮頸炎患者的正常宮頸組織。切片，80℃下烤片36 h，使用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，置于98℃的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）緩沖液中煮沸3 min，自然冷卻30 min，待溫度降至室溫，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，每次2 min，修復抗原。阻斷滅活內源性過氧化物酶，滴加一抗（HPV16/18型E6蛋白單克隆抗體、p53蛋白單克隆抗體、hWAPL免抗人多克隆抗體），置于室溫下3 h，PBS沖洗3次，每次2 min，滴加二抗，37℃下孵育30 min，PBS沖洗3次，每次2 min。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色，常規脫水、透明、干燥、封片，檢測HPV16/18型E6、p53、hWAPL蛋白的表達情況。

1.3 結果判定

HPV16/18型E6、p53蛋白主要定位于細胞核，hWAPL蛋白主要定位于細胞質，細胞核或細胞質出現棕黃色染色為陽性細胞，以陽性細胞所占比例進行評分，陽性細胞所占比例＜10%為（-），10%≤陽性細胞所占比例＜26%為（+），26%≤陽性細胞所占比例≤50%為（++），＞50%為（+++）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對所有數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用

χ

檢驗；等級資料的比較采用秩和檢驗；采用Spearman等級相關分析觀察HPV感染與p53、hWAPL蛋白陽性表達間的相關性；以

P

＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p53、hWAPL蛋白的免疫組化結果

p53蛋白主要定位于細胞核，棕黃色顆粒狀沉淀為陽性表達，在CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌組織中染色明顯，hWAPL蛋白主要定位于細胞質，棕黃色顆粒狀沉淀為陽性表達，在CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌組織中染色明顯。（圖1）

圖1 p53、hWAPL蛋白在不同宮頸組織中的表達（DAB染色，×200）

2.2 不同宮頸組織中HPV16/18型 E 6、 p53、hWAPL蛋白陽性表達情況的比較

HPV16/18型 E6、p53、hWAPL 在正常宮頸組織、CINⅠ組織、CINⅡ～Ⅲ組織和宮頸癌組織中陽性表達率均逐漸升高，正常宮頸組織＜CINⅠ組織＜CINⅡ～Ⅲ組織＜宮頸癌組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。HPV16/18型E6、p53、hWAPL蛋白在正常宮頸組織、CINⅠ組織、CINⅡ～Ⅲ組織和宮頸癌組織中的陽性表達強度逐漸升高，正常宮頸組織＜CINⅠ組織＜CINⅡ～Ⅲ組織＜宮頸癌組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。（表1、表2）

表2 不同宮頸組織中HPV16/18型 E 6、 p53、hWAPL蛋白陽性表達率的比較[ n（%）]

表2 不同宮頸組織中HPV16/18型 E 6、 p53、hWAPL蛋白陽性表達強度的比較

2.3 合并與未合并HPV感染宮頸癌患者 p53、hWAPL蛋白表達情況的比較

206例宮頸疾病患者中，合并HPV感染117例，未合并HPV感染89例。合并HPV感染患者p53、hWAPL蛋白的陽性表達率均明顯高于未合并HPV感染患者，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表3）

表3 合并與未合并HPV感染宮頸癌患者 p53、hWAPL蛋白陽性表達率的比較[ n（%）]

2.4 不同宮頸組織中HPV感染與 p53、hWAPL表達情況的相關性

Spearmen相關分析結果顯示，HPV16/18型E6蛋白的陽性表達與p53、hWAPL蛋白的陽性表達均呈正相關（

r

=0.635、0.701，

P

＜0.01）。p53蛋白的陽性表達與hWAPL蛋白的陽性表達呈正相關（

r

=0.763，

P

=0.000）。

3 討論

宮頸癌的發生機制較為復雜，是早婚早育、腫瘤基因、病毒感染及性生活混亂等多個因素共同作用的結果。多數學者認為，HPV感染是最有公認度的宮頸癌高危因素，長期HPV感染會加速宮頸癌前病變惡變為腫瘤。

HPV是最廣泛的性傳播環狀雙鏈DNA病毒，有超過100種基因型。國內外研究發現，宮頸癌前病變及宮頸癌的發生發展均與HPV感染密切相關，HPV陽性表達率隨著宮頸病變程度的加深而逐漸升高。本研究分析不同宮頸病變患者的HPV感染情況發現，HPV在正常宮頸組織、CINⅠ組織、CINⅡ～Ⅲ組織和宮頸癌組織中的陽性表達率及陽性表達強度均逐漸升高，即正常宮頸組織＜CINⅠ組織＜CINⅡ～Ⅲ組織＜宮頸癌組織，與上述研究結果一致，表明HPV感染可以促進宮頸癌前病變及宮頸癌的進展，加重病變分級。這可能是因為HPV感染會明顯增強端粒酶逆轉錄酶mRNA的水平，進而提高端粒酶活性，促進CIN向宮頸癌的進展，最終使其表達在分級上具有差異。

癌變過程中，HPV并非單獨作用，還受其他因素的影響，發揮協同作用。HPV由2個晚期蛋白及6個早期蛋白組成，早期蛋白可以調控基因組的復制和轉錄，其中E6蛋白與細胞轉化及致瘤性緊密相關。HPV16/18型E6蛋白可與p53相互作用，使p53蛋白降解而失去抑癌作用，增加宿主細胞發生惡變風險。國外研究認為，

p53

基因是與人類腫瘤發生發展密切相關的基因，p53蛋白是重要的細胞生長負調節因子，能夠影響細胞周期、血管生成、細胞分化及凋亡過程。臨床研究發現，

p53

是重要的抑癌基因，可以通過抑制DNA聚合酶功能、阻礙多核苷酸延伸，發揮抑癌作用。p53可與細胞周期蛋白結合，抑制依賴細胞周期蛋白的相關激酶，導致細胞程序性死亡，消除可能癌變的異常細胞。但

p53

基因突變后會喪失正常的生理功能，使其具有原癌基因活性，從而促進腫瘤細胞的發生發展過程。本研究結果顯示，p53蛋白的陽性表達率及陽性表達強度在正常宮頸組織、CINⅠ組織、CINⅡ～Ⅲ組織和宮頸癌組織中均逐漸升高，與李桂湖的研究結果一致，提示p53異常表達與宮頸癌的發生發展密切相關。

WAPL

基因最早在果蠅體內發現，其編碼的蛋白質可以管理異染色質結構，有利于維持姐妹染色單體的結合。

WAPL

發生變異時，染色單體各自的凝集和分離不會受到影響，但會阻礙姐妹染色單體的并列及靠近。

hWAPL

是

WAPL

在人體內的同源序列，其具體作用可能與染色體的穩定有關。Nunobiki等的研究發現，宮頸癌組織中

hWAPL

mRNA的相對表達量明顯高于癌旁組織及正常組織，推測

hWAPL

的表達可反映宮頸病變情況。本研究結果發現，hWAPL蛋白陽性表達率及陽性表達強度在正常宮頸組織、CINⅠ組織、CINⅡ～Ⅲ組織和宮頸癌組織中逐漸升高，表明

hWAPL

可能是宮頸癌特異性高表達基因，在宮頸癌前病變及宮頸癌的發生發展中發揮重要作用。李明偉等的研究發現，宮頸癌的發生與hWAPL的表密切相關，佐證了本研究結果。本研究結果顯示，合并HPV感染患者p53、hWAPL蛋白的陽性表達率均明顯高于未合并HPV感染患者；進一步相關分析發現，HPV16/18型E6蛋白的陽性表達與p53、hWAPL蛋白的陽性表達均呈正相關，提示HPV感染會上調宮頸癌組織中p53、hWAPL的表達。這可能是因為，HPV雙鏈結構中的HPV16/18型E6蛋白能與p53蛋白結合，從而降低p53蛋白的活性，甚至失去活性，發生降解，導致宮頸細胞增殖失控，誘發宮頸癌。有研究發現，HPV蛋白中E6/E7表達的逆轉錄病毒導入源自人體上皮角質細胞中后會使

hWAPL

基因的表達上調。本研究還發現，宮頸癌組織中p53蛋白的陽性表達與hWAPL蛋白的陽性表達呈正相關，提示p53、hWAPL可能通過相互作用促進表達而參與宮頸惡性病變進展。

綜上所述，合并HPV感染的宮頸癌患者宮頸癌組織中p53、hWAPL的陽性表達率和表達強度均較高，HPV16/18型E6蛋白的陽性表達與p53、hWAPL蛋白的陽性表達均呈正相關。