白鮮皮多糖純化、結(jié)構(gòu)表征以及抗過敏研究

劉 冬，韓吉欣，張 云1,，劉 娟，向育銘，曹玉華

1綠葉日用品有限公司，蘇州 215151；2江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，無錫214122

白鮮皮為蕓香科植物白鮮(DictamnusdasycarpusTurcz.)的干燥根皮，含多糖、黃酮、生物堿、甾體類化合物等成分，具有清熱燥濕、濕熱瘡毒、祛風(fēng)解毒等功效，可用于治療足癬、蕁麻疹、皮膚疹癢、濕疹等皮膚病，具有較強的抗過敏及止癢作用[1]。中草藥中提取的多糖種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且很大一部分具有促進免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[2-4]。

化妝品引起的皮膚過敏是近年來消費者主要關(guān)心的安全性問題[5]。引起皮膚過敏的主要原因是IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，經(jīng)過過敏源致敏、肥大細胞激活脫粒、免疫細胞應(yīng)答等一系列復(fù)雜過程，最終導(dǎo)致過敏反應(yīng)的發(fā)生[6]。肥大細胞是過敏反應(yīng)中的效應(yīng)細胞，在過敏性皮膚病以及炎癥過程中發(fā)揮著重要作用[7]。皮膚過敏還與皮膚的屏障功能、神經(jīng)因素以及炎癥反應(yīng)有著密不可分的聯(lián)系[8]。

大鼠嗜堿性白血病粒細胞RBL-2H3(rat basophilic leukemia cells，RBL-2H3)是大鼠嗜堿性粒細胞腫瘤株的一個亞系，細胞表面富含大量IgE高親和力受體，具有肥大細胞的多種生物學(xué)特性，是公認的能夠傳代培養(yǎng)的肥大細胞體外替代模型。β-氨基己糖甘氨酶(β-HEX)是肥大細胞的標志性顆粒，也是肥大細胞脫顆粒研究中的主要的介質(zhì)[9,10]，肥大細胞在被人工合成的多胺類化合物刺激劑C48/80(Compound 48/80)[11]刺激后會脫顆粒，在此期間β-HEX的釋放水平與肥大細胞脫顆粒的程度一致，與組胺釋放呈正相關(guān)，因此其常檢測作為肥大細胞脫顆粒的指標[12-15]。細胞膜是皮膚屏障作用的重要部分，改進后的紅細胞(red blood cell,RBC)溶血實驗可以通過紅細胞中漏出的血紅蛋白的量來判斷抗敏活性物質(zhì)對細胞膜的保護功能[8,16,17]。另外人體內(nèi)的自由基會攻擊細胞膜和蛋白質(zhì)從而導(dǎo)致細胞衰老死亡，抑制自由基的活性可有效緩解由自由基引起的細胞老化，維護皮膚屏障作用[18]。

Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)白鮮皮粗提物抑制C48/80誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒，減少組胺及β-HEX釋放，具有抗敏功效；Zhang等[20]分離出一種純凈的白鮮皮多糖，并在硫酸酯化修飾后驗證其具有抗銀屑病的功效；Shi等[21]通過小鼠耳廓腫脹實驗和小鼠毛細血管滲透性實驗驗證了其抗炎活性；Cong等[22]驗證了白鮮皮水提物可抑制DNCB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)，且具有抑制小鼠特異性細胞免疫的功能。截止到目前，對于白鮮皮粗提物的抗敏作用雖然有過一些研究進展，但還未有研究驗證白鮮皮水提物中的主要成分——白鮮皮多糖的抗敏功效。所以本實驗對白鮮皮多糖進行提取分離，并對其成分進行了理化分析；以抗敏功效為研究目的進行了抑制RBL-2H3肥大細胞脫顆粒實驗等檢測分析，為研究白鮮皮多糖作為抗敏物質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

白鮮皮(北京同仁堂，批號202009)；填料DEAE Fast Flow(博格隆生物技術(shù)有限公司，編號A10032)；木瓜蛋白酶(上海藍季科技發(fā)展有限公司，批號131025)；RBL-2H3細胞(北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號100222)；MEN-EBSS培養(yǎng)基(Hyclone，批號AF29496678)；胎牛血清(gibco，批號FBS-PA011019)；PBS緩沖溶液(Cytiva，批號AF29561133)；Compound 48/80(Sigma，批號0000101308)；對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(Sigma，批號SLBR7548V)；新鮮兔血(江南大學(xué)實驗動物中心)；十二烷基磺酸鈉SDS(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20171116)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 1525EF高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；ICS5000離子色譜儀(美國戴安公司)；Nicolet 6700全反射傅里葉紅外光譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；全波長酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 白鮮皮多糖的提取、分離、純化

取白鮮皮50 g，研磨，過20目篩后石油醚超聲30 min去脂。待石油醚自然揮發(fā)后將粉末浸泡于60%乙醇溶液中過夜，采取料液比1∶15于95 ℃冷凝回流2 h，過濾，重復(fù)以上步驟2次，合并濾液，減壓濃縮。在濃縮液中分三次加入蒸餾水100 mL，離心抽濾，加入5倍體積乙醇醇沉。沉淀復(fù)溶于去離子水中，按1.5 g/L的比例加入木瓜蛋白酶，60 ℃水浴2 h后，于95 ℃下滅酶活30 min，然后用Savage法去蛋白，其中V(氯仿)∶V(正丁醇)= 4∶1，V(Savage試劑)∶V(樣液)= 5∶1，充分振蕩后離心，小心取上清液，重復(fù)操作直至中間無蛋白層出現(xiàn)。再次加入5倍體積乙醇醇沉，沉淀依次用丙酮和無水乙醇洗滌2次，復(fù)溶于去離子水中，透析一周，凍干得白鮮皮多糖(Cortex Dictamni polysaccharides，CDPS)

稱取50 mg CDPS，溶于10 mL去離子水中，過0.45 μm濾膜后經(jīng)DEAE Fast Flow(50 cm×1 cm)離子交換柱純化，超純水洗脫，每管收集5 mL洗脫液，并利用苯酚硫酸法測定每管的吸光度A490，繪制洗脫曲線。收集主要洗脫組分，凍干得白鮮皮多糖CDPS-1和CDPS-2。

1.3.2 白鮮皮多糖的總糖和蛋白含量測定

分別利用苯酚硫酸法[23]和考馬斯亮藍G-250法[24]測定總糖和蛋白含量。得率按公式(1)計算，總糖和蛋白含量按公式(2)計算：

白鮮皮多糖=m1/m2×100%

(1)

式中：m1：提取液中總糖質(zhì)量或CDPS-1、CDPS-2的質(zhì)量(g)；m2：白鮮皮的質(zhì)量(g)。

總糖或總蛋白含量=m1/m2×100%

(2)

式中：m1：測定的CDPS、CDPS-1、CDPS-2中的總糖或蛋白的質(zhì)量(g)；m2：CDPS、CDPS-1、CDPS-2的質(zhì)量(g)。

1.3.3 白鮮皮多糖的相對分子量和單糖組成分析

利用高效凝膠過濾色譜(high performance size exclusion chromatography，HPGFC)法測定白鮮皮多糖樣品的分子量，由葡聚糖標準品(Mw：0.18、2.7、9.75、13.5、30和200 kDa)得到標準曲線。色譜條件如下：Waters 1525EF高效液相色譜儀；2 410示差折光檢測器；Empower工作站；UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm色譜柱；流動相0.1 mol/L NaNO3水溶液；流速0.8 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量50 μL。

稱取5 mg白鮮皮多糖樣品，分別加入2 mol/L三氟乙酸300 μL，100 ℃下降解12 h，氮氣吹干，加入200 μL甲醇，吹干，重復(fù)操作3次以除去三氟乙酸，然后定容至25 mL。使用離子色譜儀(脈沖安培檢測器)進行色譜分析，色譜條件如下：賽默飛戴安ICS-5000+高壓離子色譜儀(采用Dionex CarboTMPA20 3×150 mm色譜柱，柱溫30 ℃，流速：0.5 mL/min，進樣量：20 μL)洗脫程序如表1所示。分別配制單糖混合標準溶液1 mg/mL(巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)，按照上述離子色譜方法進行色譜分析，根據(jù)標準品的保留時間和峰面積，可以確定多糖樣品中的單糖組成和摩爾百分比。

表1 離子色譜洗脫程序Table 1 The elution program of ion chromatography

1.3.4 白鮮皮多糖的FT-IR分析

取干燥的白鮮皮多糖樣品1～2 mg，在600～4 000 cm-1內(nèi)進行全反射傅里葉紅外檢測。

1.3.5 RBL-2H3細胞培養(yǎng)

取RBL-2H3細胞(購于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，37 ℃解凍，將其完全置于培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清的MEN-EBSS)，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天進行一次傳代。

1.3.6 RBL-2H3細胞活性的檢測

采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測。取出處于對數(shù)生長周期的RBL-2H3細胞，消化制備成細胞懸液，用完全培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整至2.0×105

個/mL，每孔100 μL加入到96孔板中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中貼壁12 h。棄上清，分別加入用MEM-EBSS培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的CDPS樣品100 μL(10、5、1、0.5、0.1 mg/mL)，每組設(shè)置3復(fù)孔。設(shè)置對照組(不加入CDPS的細胞孔)和空白組(不接種細胞的空白組)。37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后各孔中加入含10%的CCK-8培養(yǎng)基溶液100 μL(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，恒溫箱避光孵育2 h，經(jīng)輕微震蕩，于酶標儀檢測波長450 nm測定各孔OD值。細胞活性通過公式(3)計算得到。

細胞活性=

(ODCDPS-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%

(3)

1.3.7 RBL-2H3細胞活化脫顆粒β-HEX的檢測

取出處于對數(shù)生長周期的RBL-2H3細胞，消化制備成細胞懸液，用完全培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整至2.0×105個/mL，接種至24孔板中，每孔1 000 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，棄上清，PBS緩沖液清洗兩次。分別加入用MEM-EBSS培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的CDPS樣品1 000 μL(10、5、1、0.5、0.1 mg/mL)，同時設(shè)置3個復(fù)孔，并命名為給藥組；設(shè)置對照組和空白組(不加入CDPS樣品的細胞孔)。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。棄上清，PBS緩沖液清洗兩次，給藥組及模型組每孔加入1 000 μL濃度為100 μL/mL的Compound 48/80培養(yǎng)基溶液，空白組用等量培養(yǎng)基替代，置于培養(yǎng)箱中孵育40 min后，冰水浴10 min。收集各組上清液，每孔取50 μL加入96孔板，加入50 μL顯色液(含1 mmol/L對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖溶液)，37 ℃孵育1 h后，加入200 μL終止液(Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液)終止反應(yīng)，于酶標儀檢測波長405 nm下測定各孔OD值。通過公式(4)計算得到β-HEX釋放抑制率。

β-HEX釋放抑制率=

[1-(OD給藥-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%

(4)

1.3.8 RBC溶血實驗

采集新鮮兔血，用PBS多次混洗離心去上清后，將沉淀部分稀釋至50%，用含0.1% SDS的PBS溶液將其稀釋至不同濃度(0.5%～5%)，室溫下180 rpm搖床孵育10 min，11 180 g離心1 min，取出200 μL上清液于530 nm處檢測OD值。選擇OD值在2～2.5范圍內(nèi)的RBC濃度，分別加入不同濃度SDS的PBS溶液(0.01%～0.1%)，設(shè)置陽性對照組和陰性對照組，重復(fù)上述步驟，檢測SDS濃度對細胞溶血的影響。溶血率計通過公式(5)計算得到。

溶血率=(OD實驗-OD陰性對照)/

(OD陽性對照-OD陰性對照)×100%

(5)

選取溶血率50%～70%范圍內(nèi)SDS刺激濃度，OD值在2～2.5范圍內(nèi)的RBC濃度，加入不同濃度CDPS樣品溶液(10～0.1 mg/mL)，設(shè)置陽性對照組和陰性對照組，重復(fù)上述步驟，測定樣品于SDS共同作用后的紅細胞溶血率。紅細胞的抑制率通過公式(6)計算得到。

抑制率=(1-CDPS保護溶血率/

實驗濃度SDS刺激溶血率)×100%

(6)

1.3.9 DPPH清除實驗

配置不同濃度的CDPS樣品水溶液和維生素C溶液(0.1～10 mg/mL)，將100 μL樣品溶液加入96孔板中，加入0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液100 μL，同時設(shè)置3個復(fù)孔，命名為給藥組；設(shè)置對照組和空白組，對照組加入100 μL水+100 μL DPPH乙醇溶液，空白加入100 μL的樣品溶液+100 μL的無水乙醇，同時設(shè)置3個復(fù)孔；室溫避光顯色30 min，517 nm處檢測OD值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 白鮮皮多糖純化和結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 白鮮皮多糖的分離

白鮮皮多糖CDPS經(jīng)過離子交換層析(DEAE Fast Flow)用水和0.1 mol/L的氯化鈉洗脫，洗脫曲線見圖1，洗脫后得兩個吸光度值較高的洗脫峰，分別命名為CDPS-1和CDPS-2，凍干備用。

圖1 DEAE Fast Flow色譜柱洗脫曲線Fig.1 Elution curve of DEAE Fast Flow column

2.1.2 白鮮皮多糖的總糖和總蛋白含量測定

根據(jù)苯酚硫酸法和考馬斯亮藍G-250法分別測得CDPS、CDPS-1、CDPS-2的總糖和總蛋白含量。結(jié)果如表2所示，CDPS和CDPS-1的總糖含量超過99%，蛋白含量均低于0.05%；CDPS-2得率低于0.05%。

表2 白鮮皮多糖的得率、總糖和蛋白含量Table 2 Yield,total sugar and protein content of CDPS

2.1.3 白鮮皮多糖CDPS-1的分子質(zhì)量和單糖組成分析

對含量較高的CDPS-1進行了表征。HPGFC測定結(jié)果如圖2和表3所示，色譜圖出現(xiàn)一個單峰，確認CDPS-1為單一組分，分子量為2 577 Da。單糖組成的結(jié)果如表4所示，CDPS-1主要由巖藻糖，葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖組成，摩爾比為0.41∶1.38∶3.15∶15.4∶79.61。

表3 CDPS-1的HPGFC測定結(jié)果Table 3 HPGFC determination of CDPS-1

表4 CDPS-1單糖組成離子色譜分析結(jié)果Table 4 Analysis of monosaccharide composition of CDPS-1 with ion chromatography

圖2 CDPS-1的HPGFC色譜圖Fig.2 HPGFC chromatogram of CDPS-1

2.1.4 白鮮皮多糖的FT-IR分析

由圖3可知，CDPS-1在3 313 cm-1處的吸收峰屬于-OH的伸縮振動，在2 925 cm-1處的吸收峰是C-H的伸縮振動，1 639 cm-1的吸收峰歸因于羧基的C=O鍵的振動，1 410和1 341 cm-1的吸收峰屬于δ-CH2的彎曲振動，1 147和1 076 cm-1的吸收峰歸>因于C-O-C和C-O的伸縮振動，1 011 cm-1的吸收峰表明存在吡喃糖環(huán)，922和846 cm-1的吸收峰屬于α型糖苷鍵，上述特征表明CDPS-1是以α型糖苷鍵為主的多糖化合物。

圖3 CDPS-1的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of CDPS-1

2.2 白鮮皮多糖抗過敏性能研究

2.2.1 CDPS對RBL-2H3細胞脫顆粒釋放β-HEX的抑制作用

2.2.1.1 細胞活性檢測

CDPS對RBL-2H3細胞活性的影響如圖4所示，RBL-2H3細胞與濃度范圍在0.1～10 mg/mL的CDPS共培養(yǎng)24 h后，細胞活性均高于95%，證明在此濃度范圍內(nèi)CDPS樣品對細胞無毒性影響，可用于后續(xù)實驗中。

圖4 CDPS對RBL-2H3細胞存活率的影響Fig.4 Effect of CDPS on cell viability of RBL-2H3

2.2.1.2 CDPS對RBL-2H3細胞脫顆粒釋放β-HEX的抑制作用

肥大細胞是I型變態(tài)反應(yīng)炎癥反應(yīng)的核心效應(yīng)細胞。RBL-2H3具有與肥大細胞相似的細胞結(jié)構(gòu)，細胞表面具有和肥大細胞相同的高親和力FcεR I受體，并且其能模擬肥大細胞的多種功能(如脫顆粒)，且具有可傳代培養(yǎng)和性狀穩(wěn)定等優(yōu)點，是研究與肥大細胞相關(guān)的生理、病理和藥物作用機制的理想替代模型。β-HEX是RBL-2H3細胞脫顆粒的主

要研究介質(zhì)。當RBL-2H3細胞受到刺激后脫顆粒釋放的β-HEX會分解對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷，在405 nm處出現(xiàn)吸光度峰值，以此來監(jiān)測β-HEX的釋放率。在CDPS與RBL-2H3細胞共培養(yǎng)后刺激脫粒，計算可得CDPS對RBL-2H3細胞脫顆粒釋放β-HEX的抑制作用，如圖5所示，CDPS樣品在0.1～10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對β-HEX的釋放均有抑制作用；在0.1～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，抑制率呈上升趨勢；在1～10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，抑制率呈下降趨勢；在1 mg/mL的濃度下抑制率達到峰值，為15.54%。CDPS-1在0.1～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對β-HEX的釋放均有抑制作用，且抑制率呈上升趨勢；在1 mg/mL的濃度下抑制率達到28.54%，約為CDPS的兩倍。實驗證明CDPS和CDPS-1均有良好的抗敏效果，且在1 mg/mL的給藥濃度下抑制率達到峰值。

圖5 CDPS和CDPS-1對刺激劑誘導(dǎo) RBL-2H3細胞釋放β-HEX的影響Fig.5 Effects of CDPS and CDPS-1 on the release of β-HEX in RBL-2H3 cells induced by stimulants

2.2.2 白鮮皮多糖抑制紅細胞溶血

2.2.2.1 不同濃度白鮮皮多糖CDPS的紅細胞溶血率

白鮮皮樣品CDPS對RBC毒性可通過溶血率進行判斷，實驗結(jié)果如圖6所示。實驗結(jié)果可以看出，白鮮皮樣品CDPS在0.1～10 mg/mL范圍內(nèi)幾乎沒有溶血(<2%)，即對細胞膜沒有損傷。

圖6 CDPS的RBC溶血率比較Fig.6 Comparison of RBC hemolysis rate of CDPS

2.2.2.2 不同濃度刺激物作用下紅細胞溶血效果

SDS是RBC溶血實驗的陽性對照物，通常實驗濃度為0.2%，即0.2% SDS可以達到100%的RBC溶血率。通過測定0.2%以下不同濃度梯度的SDS的RBC溶血率，篩選出特定細胞溶血率的SDS濃度，進行RBC溶血抑制實驗。實驗結(jié)果如圖7所示，在0.01%～0.04%濃度范圍內(nèi)，RBC溶血率逐漸提升，在0.05%～0.2%濃度范圍內(nèi)，RBC溶血率達到90%以上。擬選取0.02%SDS作為實驗濃度，此時RBC溶血率為55.42%。

圖7 SDS的RBC溶血率Fig.7 The hemolysis rate of red blood cells by different concentration of SDS

2.2.2.3 白鮮皮多糖紅細胞溶血抑制性能

在RBC中先加入不同濃度的CDPS，再加入濃度為0.02%的SDS，測定溶血率，與未經(jīng)CDPS處理直接加入SDS的RBC溶血率比較，即可評價CDPS是否具有保護細胞膜，使之免受刺激物損傷的作用。實驗結(jié)果如圖8所示，在CDPS給藥濃度在0.1～5 mg/mL范圍內(nèi)，RBC溶血率逐漸降低，溶血抑制率逐漸升高；在5～10 mg/mL范圍內(nèi)，RBC溶血率逐漸升高，溶血抑制率逐漸降低；在5 mg/mL時達到最優(yōu)值，溶血率為17.54%，溶血抑制率為62%。由此可見，CDPS對細胞膜有良好的保護作用，且在濃度為5 mg/mL的濃度下，RBC溶血抑制率超過60%，具有較好的抗SDS刺激效果。

圖8 CDPS與SDS共同作用后紅細胞的溶血率和抑制率Fig.8 The hemolysis rate and hemolytic inhibition rate of RBC treated with CDPS and SDS

2.2.3 白鮮皮多糖抗氧化性

白鮮皮多糖CDPS的DPPH清除率如圖9所示，在0.1～1 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，CDPS濃度對DPPH清除率沒有顯著變化；在1～10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著CDPS濃度的升高，對DPPH的清除率呈緩慢上升趨勢。在濃度為10 mg/mL的條件下DPPH清除率超過40%，說明白鮮皮多糖CDPS有一定的抗氧化作用。

圖9 CDPS的DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH radical scavenging rate of CDPS

3 結(jié)論

本研究對白鮮皮進行提取分離，獲得白鮮皮多糖CDPS，并對其進行進一步純化獲得白鮮皮多糖CDPS-1。利用GFC、IC和FT-IR等方法對CDPS-1進行表征，CDPS-1主要以α型糖苷鍵為主，分子量為2 577 Da，主要由巖藻糖，葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖組成，摩爾比為0.41∶1.38∶3.15∶15.4∶79.61。測定了CDPS對RBL-2H3細胞脫顆粒釋放β-HEX的抑制率、RBC溶血抑制率和DPPH清除率，結(jié)果顯示在0.5～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)CDPS對β-HEX的釋放抑制率和RBC細胞膜保護效果較好，峰值分別達到了28.54%和62.1%，且對DPPH有超過25%的清除率。本實驗提取的白鮮皮多糖有良好的抗敏功效，推測其對細胞膜的保護能力和抗氧化能力為抗敏機制起到一定的作用。