葫蔓藤根莖總生物堿的化學(xué)成分和抗腫瘤活性研究

沈錦煌，楊娜娜，張藝凡，鄭衛(wèi)敏，馬新華，鐘添華，張永紅*

1福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福州350122；2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，福州 350004；3自然資源部第三海洋研究所，廈門361006

葫蔓藤為馬錢科(Loganiaceae)葫蔓藤屬(Gelsemium)植物的全草。該屬植物在全世界一共有三種，分別為葫蔓藤(GelsemiumelegansBenth.)，主要分布在我國(guó)福建、浙江、云南、廣西、廣東、湖南、貴州、江西等南部地區(qū)及東南亞地區(qū)[1]；常綠鉤吻(GelsemiumsempervireusAit.)以及沼澤茉莉(GelsemiumromkimiiSmall.)，主要分布于美洲國(guó)家[2]。葫蔓藤又名鉤吻、斷腸草、大茶藥、豬人參等，為常綠木質(zhì)藤本。全株有大毒，根、莖、枝、葉供藥用，有消腫止痛、拔毒殺蟲之效；民間有用于肝、胃、宮頸、乳腺、甲狀腺等癌癥的晚期治療，有一定的療效。生物堿是葫蔓藤中的主要化學(xué)成分。此外，還含有甾烷、三萜類、香豆素類等化合物。

近年來(lái)研究表明葫蔓藤總生物堿具有抗腫瘤、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。有學(xué)者報(bào)道了嗎啡、漢防己、延胡索等六種生物堿鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)弱的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)葫蔓藤總生物堿提高痛閾的作用強(qiáng)度僅次于嗎啡[3]。葫蔓藤乙醇提取物具有對(duì)抗環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠的免疫抑制作用[4]。葫蔓藤總生物堿可顯著促進(jìn)正常小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能，對(duì)正常小鼠其他免疫功能無(wú)明顯影響[4]。研究發(fā)現(xiàn)葫蔓藤的毒性主要來(lái)自吲哚類生物堿[5]。葫蔓藤總堿中許多單體化合物療效高但毒性大，對(duì)該植物進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用葫蔓藤植物，尋找具有抗腫瘤，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等活性成分和以其為原料藥合成活性更高的化合物具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)所用儀器為AvanceⅡ 400 MHz核磁共振儀(Bruker Biospin)；LCMS-2020質(zhì)譜儀(日本島津)；Waters半制備高效液相色譜儀(美國(guó)Waters)；170SX FT-IR紅外光譜儀(Thermo Nicolet)；FD-2系列冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；BUCHI Ropavapor R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；MCI填料(日本三菱化學(xué)株式會(huì)社)；Sephadex LH-20 (瑞典GE Healthcare)；柱色譜和薄層色譜硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Lab serv)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；超凈工作臺(tái)(上海整新SZX-7P)；5%CO2及飽和濕度孵育箱(美國(guó)Thermo Forma公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司Multiskan FC型)。

實(shí)驗(yàn)所用氘代試劑為CDCl3、CD3OD(美國(guó)Sigma公司)；其他試劑均為分析純；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；噻唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；DMSO、鏈霉素、青霉素(武漢塞維爾生物科技有限公司)；胰蛋白酶(武漢塞維爾生物科技有限公司)；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人慢性髓系白血病細(xì)胞(K562)、人肺癌細(xì)胞(A549)(中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)使用的葫蔓藤根莖于2014年10月采摘于福州市臺(tái)江區(qū)，由福建醫(yī)科大學(xué)天然藥物學(xué)系張永紅教授鑒定為葫蔓藤(GelsemiumelegansBenth.)，標(biāo)本(No.zyh20141002)存放于福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室。

1.3 提取與分離

取干燥的葫蔓藤根莖5 kg，粉碎，置于容量為20 L的下口瓶中。甲醇室溫浸泡一周后，回收溶劑得醇提浸膏，用同樣方法再提取2次，合并醇提浸膏。用2%HCl溶解浸膏，抽濾，得濾液。濾液先用300 mL氯仿萃取，除去脂溶性雜質(zhì)，加5 mol/L NaOH堿化調(diào)pH>11得到紅棕色沉淀[6]。然后分別用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，合并萃取液，回收溶劑，分別得到氯仿萃取物(45.1 g)、乙酸乙酯萃取物(323.5 g)、和正丁醇萃取物(77.6 g)。將氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物合并，用等量的硅膠(100～200目)拌樣，濕法裝柱，干法上樣，洗脫劑為二氯甲烷-甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脫，每500 mL為一餾分，回收溶劑合并得到6個(gè)餾分，F(xiàn)r.1～Fr.6。Fr.1(67.2 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(CH2Cl2∶CH3OH=1∶1)洗脫，再經(jīng)半制備高效液相色譜(C18柱，甲醇∶水=65∶35)分離純化得到化合物1(25.0 mg)、2(23.0 mg)、3(10.0 mg)、6(12.0 mg)。Fr.3(56.1 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱(CH2Cl2∶CH3OH=1∶1)洗脫，再經(jīng)半制備高效液相色譜(C18柱，甲醇∶水=55∶45)分離純化得到化合物9(9.0 mg)。Fr.4(87.6 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱(CH2Cl2∶CH3OH=1∶1)洗脫，再經(jīng)半制備高效液相色譜(C18柱，甲醇∶水=45∶55)分離純化得到化合物4(5.0 mg)、5(50mg)、7(10.0 mg)、8(15.0 mg)。

1.4 抗腫瘤活性篩選

采用MTT法[7]測(cè)定部分單體化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人肺癌細(xì)胞(A549)、人慢性髓系白血病細(xì)胞(K562)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)的體外抗腫瘤活性。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以約3×104～6×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔體積100 μL，每個(gè)濃度設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)進(jìn)行兩次平行實(shí)驗(yàn)，過(guò)夜培養(yǎng)使其貼壁。取適量預(yù)先用二甲基亞砜配制的50 mg/mL藥物，用培養(yǎng)基配置成濃度160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 μM的溶液，吸取96孔板中原培養(yǎng)液，加入上述不同濃度的藥物溶液，每孔100 μL，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，加入20 μL MTT溶液(用PBS配制，pH=7.4)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，通過(guò)離心，棄去上清，隨后每孔加入二甲基亞砜150 μL，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀(BIO-RAD)于490 nm處測(cè)量各孔的OD(吸光度)值，各組取平均值，根據(jù)平均值計(jì)算抑制率，用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算IC50(半數(shù)抑制濃度)值。

抑制率=(OD空白-OD給藥)/OD空白×100%

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無(wú)色針狀結(jié)晶(甲醇)；化學(xué)式為C20H22N2O2，ESI-MS：m/z323.3[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.34(1H，d，J= 7.8 Hz，H-9)，7.18(1H，t，J= 7.8 Hz，H-11)，6.96(1H，t，J= 7.8 Hz，H-10)，6.23(1H，d，J= 7.8 Hz，H-12)，6.21(1H，dd，J= 10.7，15.5 Hz，H-19)，5.02(1H，d，J= 10.7 Hz，H-18b)，4.93(1H，d，J= 12.0 Hz，H-18a)，3.95(1H，dd，J= 2.0，10.7 Hz，H-17b)，3.93(1H，dd，J= 2.0，10.7 Hz，H-17a)，3.69(1H，s，H-3)，3.58(1H，s，H-5)，2.80(1H，d，J= 10.2 Hz，H-21b)，2.74(1H，dd，J= 2.5，14.1 Hz，H-14b)，2.46(1H，d，J= 10.2 Hz，H-21a)，2.36(1H，br d，J= 8.5 Hz，H-16)，2.31(1H，m，H-15)，2.25(3H，s，N-Me)，1.98(1H，m，H-14a)，1.97(1H，d，J= 2.3 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：180.6(C-2)，70.9(C-3)，73.2(C-5)，52.0(C-6)，55.5(C-7)，133.1(C-8)，129.2(C-9)，122.6(C-10)，129.5(C-11)，110.4(C-12)，142.6(C-13)，23.7(C-14)，37.0(C-15)，38.9(C-16)，62.2(C-17)，113.0(C-18)，139.7(C-19)，55.0(C-20)，66.5(C-21)，40.4(N-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為鉤吻堿甲(結(jié)構(gòu)見圖1)。

圖1 化合物1～9的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-9

化合物2無(wú)色柱狀結(jié)晶(氯仿)；化學(xué)式為C20H22N2O，ESI-MS：m/z307.6[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.61(1H，d，J= 5.2 Hz，H-12)，7.54(1H，d，J= 5.2 Hz，H-9)，7.36(1H，t，J= 5.2 Hz，H-11)，7.25(1H，t，J= 5.2 Hz，H-10)，5.01(1H，s，H-3)，4.84(1H，dd，J= 1.2，10.7 Hz，H-18β)，4.79(1H，dd，J= 1.2，12.0 Hz，H-18α)，4.68(1H，dd，J= 6.1，8.1 Hz，H-19)，4.26(1H，dd，J= 1.4，11.0 Hz，H-17β)，3.60(1H，d，J= 11.0 Hz，H-17α)，3.16(1H，s，H-21β)，3.07(1H，s，H-21α)，2.80(1H，m，H-16)，2.78(1H，m，H-5)，2.62(3H，s，N-Me)，2.61(1H，m，H-14β)，2.41(1H，m，H-6α)，2.36(1H，m，H-6β)，2.32(1H，m，H-15)，1.89(1H，dt，2.1，12.1 Hz，H-14α)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：185.4(C-2)，70.9(C-3)，56.8(C-5)，28.5(C-6)，57.9(C-7)，143.6(C-8)，122.9(C-9)，125.9(C-10)，128.1(C-11)，120.9(C-12)，154.8(C-13)，25.2(C-14)，33.0(C-15)，38.7(C-16)，61.3(C-17)，115.7(C-18)，137.2(C-19)，45.2(C-20)，57.7(C-21)，42.6(N-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為鉤吻素子。

化合物3淡黃色塊狀結(jié)晶(甲醇)；化學(xué)式為C21H26N2O3，ESI-MS：m/z355.4[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.48(1H，d，J= 4.4 Hz，H-9)，7.34(1H，t，J= 5.6 Hz，H-11)，7.15(1H，t，J= 5.2 Hz，H-10)，7.06(1H，d，J= 5.2 Hz，H-12)，5.47(1H，q，J= 4.4 Hz，H-19)，4.24(1H，d，J= 7.6 Hz，H-17a)，4.04(1H，d，J= 3.6 Hz，H-17b)，3.98(3H，s，N-OMe)，3.56(1H，d，J= 4.8 Hz，H-3)，3.47(2H，m，H-21)，3.38(1H，m，H-5)，2.62(1H，m，H-15)，2.47(1H，dd，J= 5.2，16.0 Hz，H-6b)，2.36(3H，s，N-Me)，2.30(1H，m，H-16)，2.29(2H，m，H-14)，1.74(1H，dd，J= 5.6，15.3 Hz，H-6a)，1.68(3H，d，J= 4.4 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：176.1(C-2)，73.6(C-3)，62.7(C-5)，29.2(C-6)，56.7(C-7)，130.4(C-8)，127.4(C-9)，124.4(C-10)，129.4(C-11)，108.5(C-12)，139.9(C-13)，26.9(C-14)，35.7(C-15)，38.6(C-16)，67.5(C-17)，12.9(C-18)，121.2(C-19)，138.2(C-20)，46.4(C-21)，42.6(N-Me)，64.0(N-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為葫蔓藤堿乙。

化合物4淡黃色固體(甲醇)；化學(xué)式為C21H24N2O3，ESI-MS：m/z353.7[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.55(1H，d，J= 7.5 Hz，H-9)，7.34(1H，m，H-11)，7.09(1H，m，H-10)，7.04(1H，d，J= 7.5 Hz，H-12)，6.20(1H，dd，J= 5.1，10.7 Hz，H-19)，5.08(1H，dd，J= 5.1，12.0 Hz，H-18α)，5.00(1H，dd，J= 5.1，12.0 Hz，H-18β)，4.08(1H，m，H-17α)，3.96(3H，s，N-OMe)，3.91(1H，m，H-17β)，3.71(1H，m，H-3)，3.52(1H，s，H-5)，2.82(1H，dd，J= 2.5，14.2 Hz，H-14α)，2.77(1H，d，J= 10.4 Hz，H-21α)，2.46(1H，d，J= 7.8 Hz，H-16)，2.36(1H，d，J= 10.4 Hz，H-21β)，2.33(1H，m，H-15)，2.25(3H，s，N-Me)，2.04(1H，m，H-14β)，1.95(1H，s，H-6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：173.2(C-2)，69.3(C-3)，71.9(C-5)，50.8(C-6)，52.2(C-7)，128.0(C-8)，128.2(C-9)，122.6(C-10)，127.8(C-11)，107.0(C-12)，139.3(C-13)，35.6(C-14)，22.5(C-15)，37.5(C-16)，62.5(C-17)，112.4(C-18)，137.9(C-19)，53.7(C-20)，65.2(C-21)，38.9(N-Me)，60.7(N-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為鉤吻綠堿。

化合物5白色粉末(氯仿)；化學(xué)式為C21H26N2O4，ESI-MS：m/z371.4[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.31(1H，d，J= 2.5 Hz，H-9)，7.04(1H，dt，J= 3.9，0.8 Hz，H-11)，6.97(1H，d，J= 8.0 Hz，H-12)，6.95(1H，dt，J= 0.8，7.8 Hz，H-10)，5.50(1H，q，J= 7.5 Hz，H-19)，4.15(1H，dd，J= 1.8，10.6 Hz，H-17α)，3.97(3H，s，N-OMe)，3.80(1H，s，H-3)，3.46(1H，s，H-5)，3.12(1H，d，J= 11.2 Hz，H-21α)，2.61(1H，dd，J= 2.6，9.0 Hz，H-14α)，2.45(1H，d，J= 11.2 Hz，H-21β)，2.36(1H，m，H-16)，2.24(3H，s，N-Me)，2.05(1H，dd，J= 2.6，9.0 Hz，H-14β)，2.01(1H，m，H-15)，2.02(1H，dd，J= 2.0，11 Hz，H-17β)1.86(1H，s，H-6)1.17(3H，d，J= 7.5 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：174.0(C-2)，69.2(C-3)，71.8(C-5)，50.1(C-6)，52.3(C-7)，127.9(C-8)，128.2(C-9)，123.1(C-10)，128.4(C-11)，107.4(C-12)，139.2(C-13)，22.3(C-14)，35.6(C-15)，39.2(C-16)，61.6(C-17)，19.4(C-18)，64.8(C-19)，56.5(C-20)，58.9(C-21)，39.2(N-Me)，63.4(N-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為19-(S)-羥基二氫鉤吻綠堿。

化合物6無(wú)色片晶(甲醇)；化學(xué)式為C19H22N2O，ESI-MS：m/z295.4[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.41(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9)，7.28(1H，d，J= 8.0 Hz，H-12)，7.04(1H，m，H-11)，6.98(1H，m，H-10)，5.40(1H，q，J= 6.1 Hz，H-19)，4.23(1H，dd，J= 2.1，9.7 Hz，H-3)，3.73(2H，m，H-21)，3.63(1H，m，H-5)，3.50(1H，dd，J= 4.1，12.7 Hz，H-17β)，3.49(1H，m，H-6β)，3.30(1H，m，H-6α)，3.24(1H，dd，J= 5.2，15.2 Hz，H-17α)，2.71(1H，m，H-15)，2.27(1H，m，H-16)，2.17(1H，dd，J= 5.8，12.0 Hz，H-14β)，1.88(1H，dd，J= 6.8，12.1 Hz，H-14α)，1.64(3H，d，J= 10.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：138.7(C-2)，49.3(C-3)，54.0(C-5)，23.1(C-6)，105.8(C-7)，127.4(C-8)，118.6(C-9)，118.8(C-10)，119.9(C-11)，112.0(C-12)，137.5(C-13)，29.1(C-14)，34.9(C-15)，43.9(C-16)，61.1(C-17)，12.6(C-18)，115.9(C-19)，140.9(C-20)，54.5(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為鉤吻堿戊。

化合物7淡黃色粉末(甲醇)；化學(xué)式為C20H24N2O2，ESI-MS：m/z325.6[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.71(1H，d，J= 7.2 Hz，H-9)，7.54(1H，m，H-12)，7.39(1H，m，H-11)，7.31(1H，m，H-10)，4.90(1H，q，J= 5.1 Hz，H-19)，4.30(1H，d，J= 1.6 Hz，H-21α)，3.64(1H，d，J= 1.6 Hz，H-21β)，3.62(1H，m，H-17β)，3.62(1H，d，J= 9.5 Hz，H-3)，3.59(1H，m，H-17α)，2.98(1H，m，H-6β)，2.96(1H，m，H-6α)，2.95(1H，m，H-14β)，2.83(1H，m，H-14α)，2.71(1H，m，H-16)，2.71(3H，s，N-Me)，2.25(1H，m，H-15)，0.67(3H，d，J= 6.3 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：187.7(C-2)，70.5(C-3)，56.5(C-5)，30.5(C-6)，57.0(C-7)，143.9(C-8)，123.8(C-9)，125.9(C-10)，127.8(C-11)，120.2(C-12)，153.6(C-13)，23.6(C-14)，37.8(C-15)，27.4(C-16)，60.6(C-17)，18.5(C-18)，66.1(C-19)，47.3(C-20)，53.2(C-21)，41.4(N-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為19-(S)-鉤吻醇?jí)A。

化合物8淡黃色粉末(甲醇)；化學(xué)式為C20H24N2O2，ESI-MS：m/z325.2[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.68(1H，d，J= 7.2 Hz，H-9)，7.43(1H，d，J= 7.6 Hz，H-12)，7.20(1H，m，H-11)，7.02(1H，m，H-10)，5.13(1H，q，J= 5.5 Hz，H-19)，4.22(1H，m，H-17β)，4.15(1H，m，H-17α)，3.93(1H，d，J= 9.5 Hz，H-3)，3.64(1H，m，H-21β)，3.52(1H，m，H-21α)，3.17(1H，m，H-6β)，3.00(1H，m，H-6α)，2.50(3H，s，N-Me)，2.46(1H，m，H-16)，2.42(1H，m，H-15)，2.31(1H，m，H-14β)，2.29(1H，m，H-14α)，0.95(3H，d，J= 6.5 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：185.7(C-2)，70.8(C-3)，56.7(C-5)，28.0(C-6)，58.7(C-7)，143.5(C-8)，123.6(C-9)，126.3(C-10)，129.0(C-11)，122.1(C-12)，154.7(C-13)，24.5(C-14)，39.7(C-15)，29.0(C-16)，61.2(C-17)，16.2(C-18)，67.2(C-19)，47.9(C-20)，56.7(C-21)，42.6(N-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為19-(R)-鉤吻醇?jí)A。

化合物9淡黃色粉末(甲醇)；化學(xué)式為C19H22N2O3，ESI-MS：m/z327.8[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.54(1H，d，J= 6.8 Hz，H-9)，7.28(1H，m，H-11)，7.06(1H，m，H-10)，6.94(1H，d，J= 7.5 Hz，H-12)，4.31(1H，m，H-3)，4.24(2H，m，H-17)，3.65(1H，m，H-5)，3.30(3H，s，N-OMe)，2.97(1H，m，H-19α)，2.59(1H，m，H-19β)，2.58(1H，m，H-16)，2.45(1H，m，H-15)，2.31(1H，m，H-6α)，2.30(1H，m，H-14β)，2.29(1H，m，H-14α)，2.26(1H，d，m，H-6β)，1.23(3H，t，J= 6.6 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：173.0(C-2)，73.3(C-3)，76.2(C-5)，38.6(C-6)，57.4(C-7)，133.5(C-8)，125.9(C-9)，124.6(C-10)，129.3(C-11)，107.8(C-12)，139.1(C-13)，27.9(C-14)，40.9(C-15)，43.6(C-16)，62.6(C-17)，10.2(C-18)，25.6(C-19)，187.5(C-20)，63.9(N-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為鉤吻素己。

2.2 體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選

以五氟尿嘧啶(5-fluorouracil)為陽(yáng)性藥，對(duì)葫蔓藤根莖總生物堿分離得到的化合物1～9，共9個(gè)化合物進(jìn)行了對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人肺癌細(xì)胞(A549)、人慢性髓系白血病細(xì)胞(K562)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)的體外抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，化合物1～4和6，對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2顯示了很好的腫瘤細(xì)胞毒抑制活性，而化合物1～9對(duì)人肺癌細(xì)胞(A549)、人慢性髓系白血病細(xì)胞(K562)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)的腫瘤抑制活性較差。其中化合物2(鉤吻素子)對(duì)HepG2的活性最好，IC50值達(dá)到了3.98±0.11 μM，化合物1和3對(duì)HepG2的IC50值分別為10.02±0.16和9.87±0.18 μM。

表1 化合物對(duì)HepG2、A549、K562和NIH3T3細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性Table 1 Cytotoxicity of compounds on HepG2,A549,K562 and

3 結(jié)論

本研究采用硅膠柱色譜、MCI-gel、Sephadex LH-20、HPLC等方法對(duì)葫蔓藤根莖的總生物堿進(jìn)行分離純化，共分離得到9個(gè)吲哚類生物堿，分別為鉤吻堿甲、鉤吻素子、葫蔓藤堿乙、鉤吻氯堿、19-(S)-羥基二氫鉤吻氯堿、鉤吻堿戊、19-(S)-鉤吻醇?jí)A、19-(R)-鉤吻醇?jí)A和鉤吻素己。并對(duì)這9個(gè)吲哚類生物堿進(jìn)行體外抗腫瘤活性測(cè)試，結(jié)果顯示葫蔓藤生物堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的抗腫瘤活性最好，而對(duì)A549、K562和NIH3T3的抑制作用較弱，鉤吻堿甲、鉤吻素子和葫蔓藤堿己對(duì)HepG2的IC50值分別為10.02±0.16、3.98±0.11和9.87±0.18 μM。其中鉤吻素子對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2具有良好的細(xì)胞毒活性，具有一定的抗腫瘤藥物開發(fā)潛力。本研究通過(guò)對(duì)葫蔓藤根莖總生物堿的化學(xué)成分和抗腫瘤活性的研究，進(jìn)一步明確葫蔓藤的抗腫瘤活性的藥效學(xué)基礎(chǔ)，為葫蔓藤生物堿開發(fā)成為高效低毒的抗腫瘤藥物提供一定的理論依據(jù)。