羅非魚腸道真菌Alternaria tenuissima SCSIO41701中的抗菌化合物

劉 瑤，張曉勇，程 霞，梁 瀟，漆淑華*

1中國科學院南海海洋研究所，中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室，廣州 510301；2中國科學院大學，北京 100049；3南方海洋科學與工程廣東省實驗室(廣州)，廣州 511458；4華南農業大學海洋學院，廣州 510642

由無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)和海豚鏈球菌(S.iniae)引起的羅非魚鏈球菌病給羅非魚養殖業帶來了嚴重經濟損失[1,2]。目前羅非魚養殖主要利用抗生素等化學藥物對鏈球菌病進行防治,但長時間地使用廣譜抗生素會誘導出耐藥菌株[1,2]。

鏈格孢菌屬(Alternaria)真菌廣泛存在于自然界，已鑒定的有300余種腐生菌、內生菌和病原菌[3]。從鏈格孢菌屬真菌中已發現許多結構新穎的活性化合物，化合物類型主要有吡喃酮類、萜類、甾醇類、芳香聚酮類、蒽醌類、生物堿類、肽類等[4-9]，部分化合物具有抑制酶、細胞毒、抗真菌、抗氧化、促進單雙子葉植物根系生長等生物活性[4-9]，其中鏈格孢菌毒素比如alternariol、alternariol methyl ether、tentoxin等具有顯著毒性[4]。細極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)是一種常見的環境真菌，有關A.tenuissima次級代謝產物研究較少[10,11]，本研究組Pan等[12,13]曾從深海沉積物來源的A.tenuissimaDFFSCS013中分離到結構新穎的螺環稠合氫化蒽醌和含氮蒽醌類化合物等。

為尋找新型抗生素，我們以羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌為指示菌，對一批從羅非魚腸道分離鑒定的真菌進行了抗菌篩選，從中篩選到一株鏈格孢菌屬真菌A.tenuissimaSCSIO41701有顯著抑制無乳鏈球菌和海豚鏈球菌生長活性。本研究采用活性追蹤法對A.tenuissimaSCSIO41701大米培養基發酵產物中抑制羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌生長的活性化合物進行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

超導核磁共振儀(Bruker AVANCE500型，內標為TMS)；分析天平(SH 200E型電子天平)；中壓制備液相色譜(CHEETAH MP200 system(Agela Technologies))；高效液相色譜儀(Shimadzu LC-20AT pump with a Shimadzu SPD-M20A Photodiode Array Detector)；高效液相色譜分析柱(YMC ODS-SP，5 μm，150 mm×4.6 mm)；高效液相色譜半制備柱(YMC-Pack ODS，S-5 μm，250 mm×10 mm)；超聲波清洗器(KQ-5000D型，昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉蒸發儀器(SB-2000，上海艾朗儀器有限公司)。

試劑：甲醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、三氟乙酸、濃硫酸、二甲基亞砜(DMSO)等均為分析純，購買自廣州試劑廠；色譜級甲醇、乙腈均為購自默克公司；怡寶純凈水購自于勝佳超市。

1.2 菌種

本實驗所使用的真菌菌株A.tenuissimaSCSIO41701是從羅非魚腸道內溶物中分離獲得，并結合形態學觀察，通過真菌DNA提取、ITS序列擴增以及序列比后鑒定為A.tenuissima。該菌株的ITS序列在GeneBank中注冊編號為MK281554，其與菌株A.tenuissimaZB11263537的ITS序列(KX783377)相似度為99%。該菌株保存在中國科學院南海海洋研究所海洋微生物中心。

1.3 培養基及發酵條件

大米培養基：大米80 g，酵母浸膏0.4 g，葡萄糖0.4 g，水120 mL。

配3 kg的大米培養基，用一升錐形瓶分裝，每瓶大米約80 g，共40瓶。將培養基滅菌，在無菌操作臺中將菌株SCSIO41701的孢子用已滅菌的竹簽刮下，轉移到無菌水中，再用已滅菌的移液槍吸取5 mL菌液轉移到培養基中，26 ℃下靜置培養30天后收瓶。

1.4 提取與分離

將3 kg大米的發酵產物用細胞破碎儀進行破碎，用丙酮浸泡約12 h，重復三次，合并提取液，減壓濃縮，再用乙酸乙酯萃取，濃縮得到浸膏約44.30 g。總浸膏經正相硅膠柱層析，用CH2Cl2/MeOH(1∶0→1∶1)溶劑系統洗脫，最后洗脫液通過TLC檢測合并得到12個組分(Fr.1～Fr.12)。用甲醇溶解時發現組分Fr.6～Fr.10中均有一部分甲醇不溶物，分別將Fr.6～Fr.10中甲醇不溶物過濾出來，TLC點板確定它們化學成分基本相同，均主要含2個化合物，只是不同組分中兩者比例不同，合并共得到10.26 g甲醇不溶物，其中來自Fr.6～Fr.10的重量分別為1.86、1.43、0.41、1.74、4.78 g。

取Fr.6中54 mg甲醇不溶物用甲醇和二氯甲烷(1∶1)的混合溶劑溶解，經薄層制備板刮板得到化合物1(32 mg)。濾液經中壓ODS柱分離，以甲醇/水/TFA(三氟乙酸)(V/V 5∶95∶0.03→100∶0∶0.03)梯度洗脫，分離得到11個亞組分(Fr.6.1～Fr.6.11)。Fr.6.2經中壓ODS柱(沖洗系統MeOH/H2O/TFA，V/V 5∶95∶0.03→100∶0∶0.03)分離得到7個亞組分(Fr.6.2.1～Fr.6.2.3)。Fr.6.2.1經HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 55∶45∶0.03)分離純化得到化合物8(2 mg，tR=22.4 min)。Fr.6.3經中壓ODS色譜柱(MeOH/H2O/TFA，V/V 5∶95∶0.03→100∶0∶0.03)分離得到7個亞組分(Fr.6.3.1～Fr.6.3.7)。Fr.6.3.2經Sephdex LH-20凝膠柱(CH2Cl2/MeOH=1∶1)除去色素后，經HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 60∶40∶0.03)分離純化得到化合物7(11.8 mg，tR=25.0 min)。Fr.6.3.5經Sephdex LH-20凝膠柱(CH2Cl2/MeOH=1∶1)除去色素后，經HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 80∶20∶0.03)分離，得到化合物4(10.1 mg，tR=37.2 min)。Fr.6.4經中壓ODS色譜柱(MeOH/H2O/TFA，V/V 5∶95∶0.03→100∶0∶0.03)分離得到10個亞組分(Fr.6.4.1～Fr.6.4.10)，Fr.6.4.4經HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 52∶48∶0.03)分離純化得到化合物5(28.6 mg，tR=17.1 min)。Fr.6.8經Sephdex LH-20凝膠柱分離(MeOH洗脫)得到3個亞組分(Fr.6.8.1～Fr.6.8.3)，Fr.6.8.3經HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 75∶20∶0.03)分離，得到化合物3(8 mg，tR=40.0 min)。將Fr.7中甲醇不溶物過濾后的濾液經中壓ODS柱分離，以甲醇/水/TFA(V/V 5∶95∶0.03→100∶0∶0.03)梯度洗脫，得到13個亞組分(Fr.7.1～Fr.7.13)。Fr.7.7經Sephdex LH-20凝膠柱分離(CH2Cl2/MeOH，V/V 1∶1)得到5個亞組分(Fr.7.7.1～Fr.7.7.5)。Fr.7.7.2經HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 54∶46∶0.03)分離，得到化合物9(41 mg，tR=12.5 min)。Fr.7.9經Sephdex LH-20凝膠柱分離(CH2Cl2/MeOH=1∶1)除去雜質，得到化合物2(15 mg)。Fr.7.13經Sephdex LH-20凝膠柱分離(CH2Cl2/MeOH=1∶1)得到3個亞組分(Fr.7.13.1～Fr.7.13.3)，Fr.7.13.2經HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 65∶35∶0.03)分離，得到化合物6(14.8 mg，tR=12.8 min)。

1.5 抗菌活性測定

1.5.1 紙片法抗菌初篩

采用紙片法，以DMSO為溶劑，將待測組分配制成20 mg/mL，待測單體化合物配制成10 mg/mL，陽性對照環丙沙星和青霉素分別配成5 mg/mL。以無乳鏈球菌和海豚鏈球菌為指示菌。細菌先搖床培養24 h(30 ℃)，用無菌水稀釋至酶標儀OD值0.01～0.02，取稀釋后的細菌150 μL，涂布于細菌培養皿中。將滅菌的紙片(直徑6 mm)用滅菌的鑷子取每6個均勻放入培養皿，以環丙沙星和青霉素(12.5 μg/disc)為陽性對照，陰性對照為DMSO。取2.5 μL待測樣品滴入紙片，每個樣品兩個平行試驗，37℃培養箱內培養1天，觀察現象。

1.5.2 96孔板法測MIC值

采用倍半稀釋法，對初篩有顯著抗菌活性的化合物1進行MIC值測定。采用96孔板，每孔加入192 μL的稀釋好菌液(OD值0.01～0.02)和8 μL樣品(10 mg/mL)，樣品最終濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5 μg/mL。最后，放入37 ℃培養箱培養，12 h后用酶標儀測量，查看結果。陽性對照每孔加入192 μL稀釋的菌液和8 μL環丙沙星，陰性對照每孔加入192 μL稀釋的菌液和8 μL DMSO。

2 結果與分析

2.1 化合物的結構鑒定

采用硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析、HPLC等色譜技術從A.tenuissimaSCSIO41701大米發酵產物中共分離純化得到9個化合物(見圖1)，通過1H NMR、13C NMR、MS等波譜技術鑒定了這些化合物的結構。

圖1 化合物1～9的化學結構 Fig.1 Structures of compounds 1-9

化合物1無色尖晶；1H NMR(700 MHz，DMSO-d6)δ：11.76(1H，s，OH-3)，10.96(1H，s，OH-5)，10.37(1H，s，OH-9)，7.26(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.72(1H，d，J=2.5 Hz，H-8)，6.64(1H，d，J=2.5 Hz，H-10)，6.37(1H，d，J=2.0 Hz，H-4)，2.70(3H，s，H-11)；13C NMR(175 MHz，DMSO-d6)δ：138.3(s，C-7)，117.6(d，C-8)，158.5(s，C-9)，101.6(d，C-10)，152.6(s，C-10a)，164.1(s，C-2)，97.4(s，C-2a)，164.7(s，C-3)，100.9(d，C-4)，165.5(s，C-5)，104.3(d，C-6)，138.1(s，C-6a)，108.8(s，C-7a)，25.3(q，C-11)。上述數據與文獻報道[14]對比一致，故鑒定該化合物為aternariol。

化合物2淡黃色固體；1H NMR(700 MHz，DMSO-d6)δ：11.83(1H，s，OH-3)，10.38(1H，s，OH-9)，7.23(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，6.73(1H，d，J=2.6 Hz，H-8)，6.65(1H，d，J=2.6 Hz，H-10)，6.62(1H，d，J=2.2 Hz，H-4)，2.73(3H，s，H-11)，3.91(3H，s，H-12)；13C NMR(175 MHz，DMSO-d6)δ：137.3(s，C-7)，117.4(d，C-8)，158.6(s，C-9)，101.3(d，C-10)，152.5(s，C-10a)，164.7(s，C-2)，98.5(s，C-2a)，164.1(s，C-3)，99.2(d，C-4)，166.2(s，C-5)，103.4(d，C-6)，137.5(s，C-6a)，108.8(s，C-7a)，25.0(q，C-11)，55.9(q，C-12)。上述數據與文獻報道[15]對比一致，故鑒定該化合物為aternariol methyl ether。

化合物3棕紅色無定形粉末；1H NMR(700 MHz，DMSO-d6)δ：11.91(1H，s，OH-3)，10.01(1H，s，OH-10)，9.15(1H，s，OH-9)，7.22(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，6.73(1H，s，H-8)，6.61(1H，d，J=2.2 Hz，H-4)，3.91(3H，s，H-12)，2.65(3H，s，H-11)；13C NMR(175 MHz，DMSO-d6)δ：138.5(s，C-6a)，98.4(s，C-2a)，164.2(s，C-3)，99.3(d，C-4)，166.2(s，C-5)，103.5(d，C-6)，164.7(s，C-2)，109.2(s，C-7a)，141.6(s，C-10a)，131.2(s，C-10)，147.1(s，C-9)，116.9(d，C-8)，126.5(s，C-7)，55.9(q，C-12)，24.6(q，C-11)。上述數據與文獻報道[16]對比一致，故鑒定該化合物為3-hydroxyalternariol 5-O-methylether。

化合物6黃色固體；1H NMR(700 MHz，DMSO-d6)δ：11.35(1H，s，OH-3)，11.32(1H，s，OH-7)，6.92(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，6.59(1H，m，H-4)，3.86(3H，s，H-5)，3.05(1H，d，J=17.7 Hz，H-9)，2.80(1H，d，J=17.7 Hz，H-9)，1.61(3H，s，H-10)；13C NMR(175 MHz，DMSO-d6)δ：196.6(s，C-8)，167.9(s，C-2)，165.7(s，C-5)，163.9(s，C-3)，149.6(s，C-7)，132.8(s，C-6a)，129.8(s，C-7a)，105.8(d，C-6)，101.7(d，C-4)，99.3(s，C-2a)，81.6(s，C-9a)，56.0(q，C-5)，46.8(t，C-9)，27.4 (q，C-10)。上述數據與文獻[18]報道的化合物4數據對比一致，由于文獻[18]沒給具體命名，在此系統命名此化合物為1，6-dihydroxy-8-methoxy-3a-methyl-3，3a- dihydrocyclopenta[c]isochromene- 2，5-dione。

2.2 抗菌活性結果

采用紙片擴散法測試發酵產物的乙酸乙酯粗提物、各組分，以及各化合物的抗菌活性結果見表1。在100 μg/disc濃度下，乙酸乙酯粗提物抑制無乳鏈球菌和海豚鏈球菌生長的抑菌圈大小均為15 mm；在50 μg/disc濃度下，各組分對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的生長均有一定的抑制作用，其中組分Fr.6～Fr.10抗菌活性較強，抑菌圈大小為14～21 mm；在25 μg/disc濃度下，化合物1～11中只有1對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌均顯示較強抗菌活性，抑菌圈大小為10 mm，而其他化合物則沒有或只有弱抗菌活性。對于活性化合物1進一步采用96孔板稀釋法測試了其MIC值，抑制無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的MIC值均為12.5 μg/mL，陽性對照藥環丙沙星抑制這兩株病原菌的MIC值均為3.125 μg/mL。

表1 組分和化合物的抗菌活性Table 1 Antibacterial activities of fractions and compounds

3 討論

在本研究中，我們通過抗菌活性追蹤分離鑒定了真菌A.tenuissimaSCSIO41701中抑制羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌生長的主要活性化合物是高含量的aternariol(1)，并通過HPLC分析和薄層點板分析，發現組分Fr.6～Fr.10中都含有大量的化合物1和2，其中化合物1是主峰，推測抗菌活性較好的組分Fr.6～Fr.10都主要通過化合物1起抗菌作用。導致化合物1和2交叉分布在這些組分中的原因，是由于經正相硅膠柱分離粗提物時高含量的化合物1和2微溶于沖洗用的二氯甲烷-甲醇溶劑系統。化合物1～6都屬于苯并吡喃內酯類化合物，比較它們的結構和抗羅非魚鏈球菌活性，推測苯環C-5上羥基和C7-C10a間共軛體系的存在對其抗菌活性起重要作用。

化合物1和2是常見的鏈格孢菌毒素，常可于谷物、水果、油菜、葵花籽、橄欖等食品中檢測到。化合物1和2均有細胞毒活性，可通過誘導基因突變，促使DNA鏈在體外產生遺傳毒性斷裂，并抑制拓撲異構酶I和IIα[14]，且2能誘導人結腸癌細胞的線粒體突變[15,22,23]。此外，化合物1有較好的抑制金色葡萄球菌、乳鏈球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的活性，MIC值均為7.82 μg/mL，并有強抑制植物病原真菌蘋果腐爛菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉菌和辣椒疫霉菌的活性，MIC值為15.63、7.82、1.96、3.91 μg/mL[24]；化合物2對枯草芽孢桿菌、假單胞菌、拉爾斯頓氏菌、青枯菌、單胞菌也有抗菌作用，MIC50值分別為28.83、34.29、27.08、29.21、30.06 μg/mL[15]。在本研究中，我們首次發現化合物1有較強的殺死羅非魚病原菌無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的活性，且在菌株A.tenuissimaSCSIO41701中產量高，但鑒于該化合物作為真菌毒素有較強的毒性，后續能否開發用于羅非魚鏈球菌病的防治還有待深入研究。