綠光條件下氮濃度對紫球藻生長和生物活性產物合成的影響

郭 帥，黃子誠，謝 點，吳黎明，鄭明敏,2，陳必鏈,2，何勇錦,2*

1福建師范大學生命科學學院；2福建師范大學 工業微生物教育部工程研究中心，福州 350117

紫球藻(Porphyridiumcruentum)是紫球藻科、紫球藻屬一種較為原始的單細胞紅藻，是紅藻門中唯一的單細胞微藻[1]。紫球藻可合成藻膽蛋白、多不飽和脂肪酸(PUFAs)、硫酸酯胞外多糖等生物活性物質[2,3]。Ismail等[4]利用藻膽蛋白制成銀納米粒子，實驗結果表明該粒子比原有藻膽蛋白表現出更強的抗菌、抗氧化和抗病毒活性。對于PUFAs，已有大量臨床研究證實了，食用PUFAs可促進神經細胞和組織的發育，降低腫瘤、心血管疾病和其它慢性疾病的發生[5]。紫球藻硫酸酯多糖，具有抗病毒、抗輻射、抗氧化、抗癌等多種生物學功能[6]。因此，開發紫球藻生物活性物質對我國生物醫藥、化妝品、保健食品等行業的發展具有重要的意義。

已有研究表明[7]，與其它光源(如白熾燈、金屬鹵化物燈)相比，發光二極管(LED)燈的使用壽命更長(約5萬 h)，生產工藝更環保，已廣泛用于培養微藻。本課題組最近研究發現，與LED源的藍燈、紅燈和白燈相比，紫球藻(Porphyridiumcruentum,FJ-12)在LED綠光條件下生長最好[8]。因此，本研究培養紫球藻所使用的光源為LED綠光。

有研究表明，紫球藻細胞的生長特性及其活性物質的產量與氮源濃度存在很大的相關性。Guihéneuf等[9]研究表明，與缺氮條件相比，紫球藻在富氮(1 g/L)條件下可促進合成藻紅蛋白或藻膽蛋白；然而，紫球藻在缺氮條件下，有利于PUFAs的合成和胞外多糖的分泌。已有的研究[10,11]也得到類似的結果。這些研究可表明，氮濃度調節著微藻細胞機體內蛋白質、油脂和糖類代謝的平衡，影響微藻儲存物質的方向。正如前人的研究結果[9-11]，氮調控只能調節紫球藻合成藻紅蛋白或合成PUFAs和胞外多糖。因此，非常有必要調控培養紫球藻的工藝條件，使其機體內的代謝處于最佳平衡狀態，進而達到協同合成藻紅蛋白、PUFAs和胞外多糖。

有研究指出[12]，在不適的光質條件下，微藻機體內的活性氧(ROS)水平上升，進而加速對藻紅蛋白或藻膽蛋白的氧化或降解，降低對光量子的吸收，影響捕光效率和光合作用。本課題組的前期研究發現，LED綠光是最適合培養紫球藻(Porphyridiumcruentum, FJ-12)的光質。因此，有必要研究，在LED綠光條件下，不同氮源濃度對紫球藻生長和活性物質合成的影響。尋找最適合協同合成紫球藻藻紅蛋白、PUFAs和胞外多糖的培養工藝。目前，關于這一方面的研究還尚未報道。基于本課題組已有的研究基礎上，選擇紫球藻(Porphyridiumcruentum,FJ-12)為藻種，在LED綠光條件下，系統評估不同氮源濃度對紫球藻細胞生長和藻膽蛋白、PUFAs與胞外硫酸酯多糖合成的影響，解決現有紫球藻協同合成生物活性物質的技術瓶頸，為產業化養殖紫球藻協同合成活性物質提供實踐依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種及光生物反應器

紫球藻(Porphyridiumcruentum,FJ-12)藻種保藏于本實驗室。培養紫球藻所使用的反應器為柱式光生物反應器(長1 000 mm，外徑50 mm和內徑45 mm)，購置于南京啟衡漁業科技有限公司。

1.2 培養基

人工海水(ASW)培養基[13]：27 g NaCl，6.6 g MgSO4·7H2O，5.6 g MgCl·6H2O，1.5 g CaCl2·2H2O，1 g KNO3，0.07 g KH2PO4，0.04 g NaHCO3，1 mol/L Tris·HCl(pH 7.6)20 mL，1 mL微量元素母液a，1 mL FeEDTA溶液b，加蒸餾水至1 L，121 ℃滅菌20 min。

微量元素母液a：4 mg ZnCl2，60 mg H3BO3，1.5 mg CoCl2·6H2O，4 mg CuCl2·2H2O，40 mg MnCl2·4H2O，37 mg (NH4)6Mo7O24，加蒸餾水至100 mL，121 ℃滅菌20 min。

FeEDTA溶液b：100 mL 0.05 mol/L Na2EDTA(pH 7.6)，240 mg FeCl3·4H2O。

1.3 實驗設計

將紫球藻細胞接種于含250 mL ASW培養基的500 mL錐形瓶中，在培養溫度為25 ℃和光照強度為3 000 Lux條件下，24 h持續光照，培養10天，藻細胞作為種子。

用1‰鹽酸溶液浸泡柱式光生物反應器處理48 h，蒸餾水沖洗反應器管內，用已滅菌的ASW培養基充分潤洗反應器3次。在LED綠燈條件下，設置KNO3濃度分別為0、0.5、1和1.5 g/L的不同實驗組，每組3管。紫球藻培養條件為：初始生物量為0.1 g/L，LED綠光強度為3 000 Lux，光照時間為24 h，培養溫度為25 ℃，通氣速率為1 L/min，通氣中的CO2為5 %，裝液量為1 L。培養過程中，每3天取樣測定細胞生物量和生化組分指標。

1.4 生物量的測定

取藻液10 mL，在8 000 rpm 條件下離心10 min，棄去上清液收集藻泥，用蒸餾水洗滌藻泥，重復操作兩次，最后將處理好的藻泥置于80 ℃干燥箱中烘干至恒重，測定其干重。紫球藻生物產量的計算公式為：

由于前置胎盤胎盤覆蓋于子宮前壁切口位置，傳統手術瘢痕可能會影響胎盤移動，最終造成胎盤前置，加之子宮瘢痕內膜過薄，使其絨毛組織侵入到子宮肌層中，使其胎盤植入幾率明顯提升。在進行本次研究發現，全部患者均符合手術病理標準，患者經過在腹彩超多普勒超聲的檢查發現，其診斷率為95.5%（85/89），漏診率4.9%（4/89）。對此，前置胎盤并發胎盤植入臨床診斷中，腹彩色超聲多普勒具有較高準確率，且呈現無創安全的特點，具備臨床推廣與使用價值。

紫球藻生物產量(mg/(L·d))=

微藻生物量(mg/L)/培養時間

1.5 藻膽蛋白濃度的測定

依據Marcati等[14]的方法，測定藻膽蛋白的步驟如下：取3 mL藻液離心收集藻泥，加入5 mL PBS緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)，放入-20 ℃冰箱中反復凍融，至藻泥顏色變白，離心收集上清液分別于650、620和565 nm波長條件下測吸光值，藻膽蛋白中別藻藍蛋白(APC)、藻藍蛋白(R-PC)和藻紅蛋白(B-PE)濃度換算用如下公式：

R-PC(mg/mL) = (OD620-0.7×OD650)/7.38

APC(mg/mL) = (OD650-0.19×OD620)/5.65

B-PE (mg/mL) = (OD565-2.8×(R-PC)-1.34×(APC))/12.7

紫球藻別藻藍蛋白、藻藍蛋白和藻紅蛋白產量計算使用如下公式：

R-PC產量(mg/(L·d))=R-PC濃度/培養時間

APC產量(mg/(L·d))=APC濃度/培養時間

1.6 胞外多糖的測定

根據Dubois等[15]的方法測定微藻胞外多糖含量，取1 mL的藻液，離心(8 000 rpm，5 min)收集上清液。取適量的上清液，加入5 mL 98%硫酸和1 mL 6%苯酚溶液，反應30 min后，在波長490 nm條件下測定吸光值，D-葡萄糖作為測定微藻胞外多糖的標準品。測定公式為：

S=174.83×OD490-0.95，R2=0.997

其中，S為胞外多糖的濃度(mg/L)；OD490為490 nm的吸光值。

紫球藻胞外多糖產量的計算使用如下公式：

紫球藻胞外多糖產量(mg/(L·d))=紫球藻胞外多糖濃度/培養時間

1.7 樣品的甲酯化和脂肪酸組成的測定

取藻液5 mL離心收集藻泥，加1 mL 1%硫酸-甲醇溶液，加入100 μL 1 mol/L的BHT(2，6-二叔丁基對甲酚)溶液，置于70 ℃水浴處理45 min，待樣品冷卻至室溫，加2 mL含十七酸甲酯(0.5 mg/L)的正己烷和2 mL蒸餾水，4 000 rpm離心5 min，取上清液的正己烷于試管中，加1 mL正己烷再次萃取，重復3次，合并提取的正己烷溶劑，氮吹去除正己烷，最后加1 mL正己烷溶解脂肪酸甲酯。37種脂肪酸甲酯標準品和十七烷酸甲酯(0.1 mg/mL)對處理樣品進行定性定量分析。利用氣相色譜儀(SCION 436-GC，Bruker)[8]測定樣品的可皂化脂肪酸(TFA)濃度(mg/L)。

紫球藻ARA和EPA產量的計算公式為：

ARA產量(mg/(L·d))=紫球藻TFAs濃度×ARA含量/培養時間

EPA產量(mg/(L·d))=紫球藻TFAs濃度×EPA含量/培養時間

2 結果與分析

2.1 不同氮濃度條件下紫球藻的生長情況

在不同氮濃度條件下，紫球藻的生長情況如圖1所示。由圖1可得，在缺氮培養基條件下，紫球藻細胞的生長緩慢，其生物量維持在0.1～0.55 g/L。與其他氮濃度相比，紫球藻在1 g/L氮濃度條件下可獲得最大生物量(3.09 g/L)。Kim等[16]在研究紫光(400 nm)、藍光(465 nm)、綠光(520 nm)、黃光(590 nm)和紅光(625 nm)對培養紫球藻的生長的影響，結果表明：紫球藻在綠色波長條件下培養14天，可獲得最大生物量(1.28 g/L)。Li等[10]研究低氮(3.5 mM)、中氮(5.9 mM)和高氮(17.6 mM)對培養紫球藻生長的影響，結果表明：紫球藻在高氮條件下可獲得最大生物量(5.54 g/L)。在本研究中(1 g/L KNO3即為9.9 mM)，紫球藻獲得的最高生物量比Li等[10]的研究結果低，這可能是因為培養紫球藻的培養基氮濃度的不同和培養條件的差異(如不同光質)所引起的。

圖1 不同氮濃度對紫球藻生長的影響Fig.1 Effect of different nitrogen concentration on P.cruentum cell growth

2.2 不同氮濃度條件下紫球藻藻膽蛋白的合成情況

紫球藻所合成藻膽蛋白包括別藻藍蛋白、藻紅蛋白和藻藍蛋白。在LED綠光條件下，不同氮濃度對紫球藻APC、B-PE和R-PC合成性能的影響，見圖2所示。從圖2結果可以看出，在缺氮條件下，紫球藻所合成APC、B-PE和R-PC濃度先上升后下降的趨勢；當培養結束后，紫球藻APC、B-PE和R-PC濃度分別為0.24、2.52和0.58 mg/L。這結果表明，缺氮條件下紫球藻進行光合作用產生的氧氣會提高機體內活性氧水平，使葉綠體類囊體腔內的pH值下降，酸化環境易導致藻膽蛋白的分解[17]。

對于氮濃度為0.5 g/L時，紫球藻APC、B-PE和R-PC的最高濃度處于第12～15天、第15天和第15天；當培養時間超過15天，藻細胞可能已耗盡了培養基中的氮元素，進而影響對藻膽蛋白的合成，導致APC、B-PE和R-PC濃度下降。當氮濃度分別提高到1 g/L和1.5 g/L時，紫球藻所合成的APC、B-PE和R-PC濃度能維持在較高水平。這可能是因為充足氮濃度可滿足紫球藻細胞合成所需的蛋白質。值得注意的是，Li等[10，11]的研究選擇白光培養紫球藻，其合成的藻膽蛋白濃度在中后期(9～12天)則呈現下降趨勢。在本研究中，選擇LED綠光作為培養紫球藻的光源，則不會出現下降趨勢。一方面，與白光光源相比，綠色具有較低的光量子吸收值，可能降低類囊體腔的ROS水平，避免藻膽蛋白的分解[18]。另一方面，紫球藻葉綠素a和捕光藻膽素可能賦予其對綠光的適應，促進光合效應[19]。因此，從圖2結果可得，最適合紫球藻合成藻膽蛋白的氮濃度為1～1.5 g/L。

圖2 不同氮濃度對紫球藻藻膽蛋白含量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen concentrations on phycobiliprotein content of P.cruentum

2.3 不同氮濃度條件下紫球藻胞外多糖的合成情況

不同氮濃度對紫球藻合成胞外多糖的影響，結果見圖3。由圖3可知，在缺氮條件下，隨著培養時間的延長，紫球藻胞外多糖濃度逐漸升高。已有的研究也證實，紫球藻在缺氮條件下,紫球藻細胞光合作用固定二氧化碳主要用于合成胞外多糖[20]。當氮濃度從0.5 g/L提高到1 g/L時，經18天培養后，紫球藻胞外多糖的濃度從103.81 mg/L提高到255.62 mg/L。但是，在氮濃度為1 g/L和1.5 g/L條件下的紫球藻所合成胞外多糖濃度則無顯著差異。因此，最適合紫球藻合成胞外多糖的氮濃度為1～1.5 g/L。

圖3 不同氮濃度對紫球藻胞外多糖含量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen concentrations on extracellular polysaccharides content of P.cruentum

2.4 不同氮濃度條件下紫球藻油脂的合成情況

圖4為不同氮濃度條件下紫球藻合成油脂的結果。已有的研究[10,11,21]和本研究的結果都表明，缺氮有利于紫球藻油脂的合成。但是，與缺氮條件相比，紫球藻在0.5、1和1.5 g/L三個氮濃度條件下具有更高油脂濃度。這主要是因為微藻在這三個氮濃度條件下具有更高的生物量(見圖1)。同時，與其他氮濃度相比，在氮濃度為1 g/L下的紫球藻可合成最大的油脂濃度233.86 mg/L。

圖4 不同氮濃度對紫球藻TFAs含量的影響Fig.4 Effects of different nitrogen concentrations on TFAs content of P.cruentum

在LED綠光下，經18天培養后，采收紫球藻細胞，利用氣相色譜法分析其脂肪酸組成，結果見表1。由表1可知，紫球藻所合成的主要脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA/C20∶5(ω-3))、花生四烯酸(ARA/C20∶4(ω-6))、亞油酸(LA/C18∶2(ω-6))和棕櫚酸(PA/C16∶0)。此外，實驗結果表明，不同氮濃度會明顯影響紫球藻某些脂肪酸的合成。如，在缺氮條件下，紫球藻有利于棕櫚酸和亞油酸的合成。但是，隨著培養基氮濃度的升高，紫球藻油脂中棕櫚酸和亞油酸的比例呈下降趨勢；相反的是，ARA和EPA的比例則呈上升趨勢。Breuer等[22]和Asgharpour等[23]研究也表明，在缺氮的條件下，紫球藻傾向合成棕櫚酸和亞油酸，不利于ARA和EPA的積累。Hu等[21]考察氮磷脅迫對紫球藻脂肪酸合成的影響，結果發現紫球藻在氮充足和磷限制的條件下可提高ARA和EPA的合成。這些已有的研究和本研究的結果都可表明，氮濃度水平可調控紫球藻機體某些特定脂肪酸的合成。因此，從紫球藻脂肪酸組成上，高氮(1.5 g/L)有利于紫球藻合成ARA和EPA。

表1 紫球藻在不同氮濃度實驗組培養18天后的脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of P.cruentum after cultivation for 18 days under the different nitrogen concentrations media treatments

2.5 不同氮濃度條件下的紫球藻生物產量和活性物質產量

經培養18天后，分析不同氮濃度條件下的紫球藻生物產量和活性物質產量，結果見圖5。在紫球藻生物產量方面，在氮濃度為1 g/L條件下培養紫球藻可獲得最大生物產量為150 mg/(L·d)。在藻膽蛋白產量方面，紫球藻在1 g/L和1.5 g/L的氮濃度下可獲得最大APC和R-PC產量；對于B-PE，紫球藻B-PE產量隨氮濃度的升高而升高。在胞外多糖產量方面，紫球藻獲得最大胞外多糖所需的氮濃度為1.5 g/L；但是，氮濃度為1 g/L和1.5 g/L下的紫球藻胞外多糖產量則無顯著差異。對于ARA產量方面，紫球藻在1 g/L和1.5 g/L的氮濃度下獲得的ARA產量無顯著差異，但顯著高于其他氮濃度下的值。EPA產量的變化趨勢與ARA產量趨勢是一致的。因此，基于圖5的結果，為了節省培養成本，選擇氮濃度為1 g/L作為紫球藻FJ-12培養的最佳氮濃度，不僅有利于紫球藻細胞的生長，還可以促進藻膽蛋白、胞外硫酸酯多糖和PUFAs活性產物的聯產協同合成，克服了現有技術調控紫球藻合成多種活性物質的瓶頸問題。

圖5 不同氮濃度條件下的紫球藻生物產量和活性物質產量Fig.5 Biomass and active substance productivity of P.cruentum under different nitrogen concentrations

在LED綠光條件下，探究了不同氮濃度(0、0.5、1和1.5 g/L)對紫球藻細胞的生長和活性產物合成的影響。實驗結果表明：紫球藻細胞在氮濃度為1 g/L條件下可獲得最大的生物量(3.09 g/L)；在氮濃度為1 g/L和1.5 g/L條件下，紫球藻細胞可獲得較高的APC、B-PE、R-PC、胞外多糖、ARA和EPA濃度和產量。此外，與其他前人研究不同的是，本研究在LED綠光條件下，紫球藻在高氮濃度條件下所合成的這些活性物質不會出現下降趨勢，可實現紫球藻聯產協同合成藻膽蛋白、胞外硫酸酯多糖和PUFAs，為規模化養殖紫球藻多聯產開發生物活性物質提供實踐依據。