CC趨化因子配體22在胃癌病人外周血中的表達及意義

王曉龍 陳亮 曹洪濤 林波 湯婷婷 馬克強 嵇騰飛 曹天生 王健 張文偉 楊建榮 盧卓才 由田 何青青 繆巍

胃癌是消化系統常見的消化系統腫瘤，是全球第3大腫瘤相關性死亡的原因[1]。幽門螺桿菌、飲食、遺傳因素等與胃癌的發生發展密切相關[2]。巨噬細胞、樹突狀細胞、單核細胞、中性粒細胞及其表達的細胞因子、趨化因子等在胃癌發生發展中起重要作用[3]。Chemokine(C-C motif) ligand 22(CCL22)是巨噬細胞、樹突狀細胞等表達的一種趨化因子，可以識別并趨化表達CCR4的T-reg細胞、Th2細胞等，抑制機體針對病原體、腫瘤細胞的免疫反應，促進病原體持續感染、腫瘤發展[4-5]。胃癌組織中CCR4表達水平增高[6]。本研究收集胃癌病人外周血標本，檢測外周血中CCL22表達水平，并分析其表達水平與胃癌臨床分期的相關性，研究CCL22對胃癌細胞的趨化作用，探討CCL22在胃癌發生發展中的作用。

對象與方法

一、對象

2016年1月～2019年1月在青海大學附屬醫院和南方醫科大學附屬花都醫院胃腸外科住院的胃癌病人55例，男性40例，女性15例，年齡41～65歲，平均年齡50.3歲，經病理學檢查確診。按胃癌最新分期標準分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期17例，Ⅲ期13例，Ⅳ期15例。術前檢查未發現主要臟器的器質性病變，未行放化療或生物治療。對照組30例，男性24例，女性6例，年齡38～58歲，平均年齡48.2歲，為健康體檢者。所有入組者無并發HIV、乙型或丙型病毒性肝炎，未使用免疫抑制劑，排除自身免疫性疾病。

二、方法

1.標本收集：于晨起采空腹肘靜脈血10 ml，5 ml裝入干燥無菌非抗凝真空管，室溫靜置60分鐘后自行凝固，再以1 500 r/min離心12分鐘，取上清用EP管分裝，放入超低溫冰箱保存。5 ml放入無菌含肝素的抗凝管，Ficoll密度梯度離心法分離、純化外周血單個核細胞。

2.總RNA提取及定量PCR：細胞總RNA提取采用用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)。細胞總RNA反轉錄為cDNA采用反轉錄試劑盒(Toyobo公司,Japan)。然后用real-time PCR Faststart Universal SYBR Green Master(Rox)試劑(Roche公司)擴增。擴增CCL22的引物如下[7]：F:5＇-ATTACGTCCGTTACCGTCTGC-3＇，R:5＇-TCCCTGAAGGTTAGCAACACC-3＇。

3.ELISA ：血清中CCL22蛋白表達水平用美國R&D公司ELISA試劑盒(貨號：DMD00)檢測，具體步驟按說明書操作。

4.趨化實驗：用Biocoat細胞培養小室(Biocoat Invasion Chamber，BD公司)檢測CCL22對胃癌細胞株SNU216的趨化作用。將5×105個胃癌細胞置入chamber上層，加入或不加入不同濃度的CCR4抗體(Santa Cruz公司)，用無血清dulbecco's modified eagle medium(DMEM)培養液培養，將CCL22蛋白加入chamber下層，將chamber放入培養箱孵育，6～24小時后Giemsa染色，光鏡下計數，檢測CCL22對胃癌細胞遷移的作用。

三、統計學方法

采用SPSS 17.0軟件分析數據。組間均數比較采用t檢驗或方差分析。相關性分析采用Pearson's相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1.外周血中CCL22 RNA表達見圖1。結果顯示，胃癌組CCL22mRNA表達高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 兩組病人外周血中CCL22 mRNA表達水平

2.外周血中CCL22蛋白質表達見圖2。結果顯示，胃癌組CCL22蛋白表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05) 。

圖2 兩組病人外周血中CCL22蛋白質表達水平

3.外周血中CCL22表達水平見表1。結果顯示，胃癌組病人外周血CCL22表達水平隨胃癌分期而逐漸增高。

表1 不同胃癌分期病人外周血CCL22表達(pg/ml)

4.CCL22可趨化胃癌細胞：如圖3所示，CCL22呈劑量依賴性誘導胃癌細胞株SNU216遷移(圖3A)。加入CCR4抗體阻斷CCL22誘導的SNU216細胞遷移(圖3B)。

圖3 A:CCL22誘導胃癌細胞遷移;B:CCR4抗體阻斷CCL22誘導的胃癌細胞遷移

討論

本研究發現，胃癌病人外周血中趨化因子CCL22表達增高，且其表達水平隨胃癌分期而逐漸增高，CCL22呈劑量依賴性誘導胃癌細胞遷移。CCL22是一種趨化因子，可以趨化Treg細胞、Th2細胞、單核細胞等，抑制機體針對腫瘤細胞的免疫反應，促進腫瘤發展[4-5]。

有研究證實，胃癌組織中Treg細胞數量增多，且Treg細胞表面CCR4表達增高[8]，而CCR4是CCL22識別并結合的受體。CCL22識別并結合表達CCR4的免疫細胞，發揮趨化作用。CCL22通過與CCR4識別、結合，趨化Treg細胞等免疫細胞聚集至胃癌組織，改變腫瘤浸潤淋巴細胞的組成，在腫瘤局部發揮免疫抑制作用，有利于腫瘤的生長。因此，本研究推測針對CCL22的表達可能作為治療胃癌的一個靶點。

有研究發現，胃癌組織中趨化因子CCL20、CCL17表達增高[1，9]，CCL20通過識別結合表達CCR6、CCL17通過識別結合表達CCR4的免疫細胞浸潤至胃癌組織，參與胃癌的發病。本研究發現，胃癌病人外周血中CCL22表達增高，且其表達水平與胃癌分期呈正相關，而CCL22亦可識別并結合CCR4，發揮趨化作用。研究報道胃癌細胞表達CCR4[10]。我們利用細胞模型進行趨化實驗，研究發現，CCL22呈劑量依賴性誘導胃癌細胞遷移，CCR4抗體可阻斷CCL22誘導的胃癌細胞遷移。因此，CCL22可能通過識別結合表達CCR4的免疫細胞參與胃癌的發生發展，亦可能通過識別結合表達CCR4的胃癌細胞促進胃癌轉移。

綜上所述，胃癌病人外周血中CCL22表達增高，其表達水平隨胃癌分期而逐漸增高，CCL22可趨化胃癌細胞遷移，CCL22可能參與胃癌的發生、發展、轉移。