代煎中藥湯劑微生物限度研究*

安雅婷，楊新建，張善革，付彬，李學林，王雷

(1.天津市中醫藥研究院附屬醫院藥學部，天津 300120；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，鄭州 450000)

1 儀器與試藥

1.1儀器 YJD20D-GL十功能自動煎藥機(北京東華原醫療設備有限責任公司)，YB50-250B中藥湯劑包裝機(北京東華原醫療設備有限責任公司)，GH802-1A凈化工作臺(天津市泰斯特儀器有限公司)，HTY-2000B型HTY型集菌儀(杭州泰林生物技術設備有限公司)，SHP-200B型生化培養箱(天津市天宇實驗儀器有限公司)，HHB11420型電熱恒溫培養箱(天津市實驗儀器廠)，MS105DU型萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，感量：0.1 mg)，AS-3120超聲波清洗器(天津市奧特賽恩斯儀器有限公司)，YXQG02型手提式電熱壓力蒸汽消毒器(山東安得醫療科技有限公司)，量瓶，量筒(F=1.000 0)。

1.2試藥 中藥飲片均購于安徽省亳州市中藥飲片廠，經天津市中醫藥研究院附屬醫院長征醫院制劑室檢驗合格；中藥湯劑(天津市中醫藥研究院附屬醫院煎藥室制備，規格：每袋200 mL)；胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號：151016)、腸道菌增菌液體培養基(批號：150919)、胰酪大豆胨液體培養基(批號：151028)、麥康凱液體培養基(批號：1511062)、麥康凱瓊脂培養基(批號：151026)均由北京三藥科技開發公司提供。

2 方法與結果

2.1待測中藥湯劑的制備

2.1.1煎煮 按照本院煎藥室煎藥機煎煮操作規程進行煎煮。一煎加水浸過藥面2～5 cm(先行浸泡≥30 min)，煎煮時，先用武火加熱達到沸騰，再改用文火慢煎，并保持微沸，煎煮至規定時間(≥30 min)。解表類、清熱類、芳香類藥物不宜久煎，煮沸后再煎(<30 min)；滋補類藥物先用武火煮沸，改用文火慢煎(>30 min)。二煎加水量少于一煎加水量，或根據預期得液量、二煎吸水量及二煎過程中的藥液損耗計算加水量。先用武火加熱達沸騰，再改用文火煎煮，并保持微沸煎煮至規定時間。一般第二煎煎煮時間比第一煎時間略短(≥20 min)。

2.1.2包裝 二煎煎煮完成之后，將二煎藥液與一煎藥液混合，并使混合后的藥液沸騰，采用中藥湯劑包裝機包裝。

2.1.3貯存方式 分別采用冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存和室溫避光(20±5 ℃)儲存，均儲存21 d。

2.2制備湯劑所用處方 選擇本院制劑室現有質量標準且微生物限度檢驗方法已經天津市藥品檢驗研究院或區藥品檢驗所驗證的32個制劑處方作為研究對象，處方組成見表1。按其功能主治主要分為兩類，處方1-23主要具有清熱、祛濕等作用；處方24-32主要具有益氣、養陰等作用。處方29-30含有非植物類飲片。

表1 32個制劑處方組成

2.3微生物限度檢驗方法及結果

2.3.1微生物限度檢驗方法 《中華人民共和國藥典》2020年版四部0181合劑項[1]規定，非無菌產品微生物限度(《中華人民共和國藥典》2020年版四部 1105，1106，1107)檢查：口服給藥液體制劑每毫升需氧菌數不得大于200 cfu· mL-1，霉菌和酵母菌數不得大于20 cfu· mL-1，不得檢出大腸埃希菌(控制菌)。由于中藥煎煮液處方復雜，其成分可能對微生物培養有干擾作用，因此按《中華人民共和國藥典》2020年版微生物限度檢查法薄膜過濾法[1]進行檢測。取各組中藥煎煮液2份，充分混勻，立即吸取樣品溶液10 mL，加pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨溶液稀釋至100 mL，得1：10供試液，置渦旋振蕩器上充分混勻1 min，靜置，取上清液10 mL加入無菌濾筒，用pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨溶液沖洗3次，每次100 mL，抽濾。取出濾膜，菌面朝上貼于培養基平板上在培養箱培養；以pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨溶液為空白對照，同法檢測。另取1：10供試液10 mL，加至胰酪大豆胨液體培養基100 mL進行大腸埃希菌檢查；取pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨溶液作為空白對照，同法檢測。以該處方制成湯劑并包裝完成為第0天，分別于第0，1，3，7，14，21天進行性狀觀察和微生物限度檢測。

逃學失敗被家中或學校任何一方面發覺時，兩方面總得各挨一頓打。在學校得自己把板凳搬到孔夫子牌位前，伏在上面受笞。處罰過后還要對孔夫子牌位作一揖，表示懺悔。有時又常常罰跪至一根香時間。我一面被處罰跪在房中的一隅，一面便記著各種事情，此時想象恰如生了一對翅膀，憑經驗飛到各樣動人事物上去。按照天氣寒暖，想到河中的鱖魚被釣起離水以后拔刺的情形，想到天上飛滿風箏的情形，想到空山中歌呼的黃鸝，想到樹木上累累的果實。我應感謝那種處罰，使我無法同自然接近時，給我一個練習想象力的機會。

2.3.2微生物限度檢測結果

(1)各組代煎湯劑性狀。分別于第0，1，3，7，14，21天，隨機抽取“2.1”項每組代煎湯劑各2份，肉眼觀察湯劑是否有變色、結塊等性狀變化。冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存和室溫避光(20±5 ℃)儲存的代煎湯劑從第3天開始，在煎藥袋底部逐漸有絮狀沉淀出現，含有動物類中藥飲片的代煎湯劑(如處方30：炒僵蠶)，與其他湯劑比較沉淀較多，但輕輕搖晃煎藥袋，可使之重新混懸，無結塊產生，無顏色變化。

(2)各組代煎湯劑微生物限度檢驗結果。分別于第0，1，3，7，14，21天隨機抽取“2.1”項每組代煎湯劑各2份，行微生物限度檢驗，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部0181合劑[1]規定，及非無菌產品微生物限度(《中華人民共和國藥典》2020年版四部 1105，1106，1107)檢查，進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，及控制菌(大腸埃希菌)檢查。結果見表2，3。表2為冰箱冷藏室(2～8 ℃)各組湯劑微生物限度檢測結果，表3為室溫避光(20±5 ℃)各組湯劑微生物限度檢測結果。

表2 冰箱冷藏室(2～8 ℃)各組湯劑微生物限度檢測結果

表3 室溫避光(20±5 ℃)各組湯劑微生物限度檢測結果

隨儲存時間延長，在兩種貯藏條件下，各組代煎湯劑均未檢出控制菌。置于冰箱冷藏室(2～8 ℃)的代煎湯劑在隨機抽檢的第0，1，3，7天均未檢測出需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌。在隨機抽檢第14天，有18組代煎湯劑檢出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有29組代煎湯劑檢出霉菌和酵母菌，含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范圍內。在隨機抽檢第21天，有28組代煎湯劑檢出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有30組代煎湯劑檢出霉菌和酵母菌，含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范圍內。隨著儲存時間延長，冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存的代煎湯劑，第21天抽檢樣品中檢出需氧菌數、霉菌和酵母菌數均高于第14天的抽檢樣品，差異有統計學意義(P<0.01)。室溫避光(20±5 ℃)儲存的代煎湯劑在隨機抽檢第0，1，3天均未檢測出需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌。隨機抽檢第7天，有7組代煎湯劑檢出霉菌和酵母菌含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范圍內。在隨機抽檢第14天有29組代煎湯劑檢出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有28組代煎湯劑檢出霉菌和酵母菌，含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范圍內。在隨機抽檢的第21天，有29組代煎湯劑檢出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有32組代煎湯劑檢出霉菌和酵母菌，其中27組含量≤20 cfu·mL-1，在合格范圍內；有5組霉菌和酵母菌含量>20 cfu·mL-1，微生物限度不合格。

①兩類湯劑間微生物限度比較：對清熱類湯劑和補益類湯劑的微生物進行比較，采用SPSS22版軟件，運行獨立樣本t檢驗，均P>0.05，兩類代煎湯劑微生物數量差異無統計學意義。

②相同取樣時間，不同貯藏條件比較：采用SPSS 22版軟件，運行配對樣本t檢驗。第14，21天，室溫避光(20±5 ℃)儲存代煎湯劑中產生的需氧菌數量高于冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存樣品，均差異有統計學意義(P<0.05)。第14天，室溫避光(20±5 ℃)儲存代煎湯劑中的霉菌和酵母菌數量高于冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存樣品，但差異無統計學意義(P>0.05)。第21天，室溫避光(20±5 ℃)儲存代煎湯劑的霉菌和酵母菌數量高于冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存樣品，差異有統計學意義(P<0.01)。

③相同貯藏條件，不同取樣時間下比較：采用SPSS 22版軟件，運行配對樣本t檢驗。冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存代煎湯劑，第21天抽檢樣品中檢出需氧菌數、霉菌和酵母菌數均高于第14天抽檢樣品，差異有統計學意義(P<0.01)。室溫避光(20±5 ℃)儲存代煎湯劑，第21天抽檢樣品中檢出需氧菌數、霉菌和酵母菌數均高于第14天抽檢樣品，霉菌和酵母菌數差異有統計學意義(P<0.01)；需氧菌數差異無統計學意義(P>0.05)。

整體看，隨著時間延長，各組代煎湯劑微生物有隨之增長趨勢，但各組代煎湯劑本身并無明顯規律。

3 討論

中藥湯劑在我國至今已有數千年應用歷史，現代中藥湯劑質量研究主要集中于煎煮過程控制對其成品煎液得量、密度、某些指標性成分含量的影響方面。在對湯劑成品質量的考察方面，隨著現代分析技術的發展，從考察處方中某些單一成分定量分析，到對中藥配方顆粒、經典方湯劑、中成藥多成分、多靶點全面控制。但由于代煎中藥湯劑多為臨床醫生根據患者病情開具，一人一方，因此對代煎中藥湯劑的質量控制研究困難重重。由于煎藥機及煎藥中心的發展，以及煎煮方法和器具使用等的諸多限制，患者多選擇代煎，中藥湯劑作為一種藥學延伸服務，應該有其相應的質量控制標準。已有研究表明，煎藥室通風情況良好可減少交叉污染，操作環境干凈整潔可減少次生污染，保障煎藥設備、用具、潔具等的清潔到位可減少交叉污染或次生污染，盡量減少包裝材料材質、儲藏和使用過程中引入污染，以及操作人員嚴格按照操作規程執行，都會對代煎中藥湯劑微生物限度產生影響[2]。而2020年版《中華人民共和國藥典》編制過程中，雖然對中藥飲片進行微生物限度檢驗征求過意見，但由于實際情況所限，并未收載需煎煮飲片的微生物限度標準。本研究依托國家重點研發計劃項目“中藥飲片智能調劑與煎煮設備關鍵技術研究”，建立“中藥湯劑煎煮技術規范”，從同質煎藥流程及方法、提高代煎湯劑質量、保護患者健康、降低用藥風險等方面入手，對代煎中藥湯劑微生物限度進行研究。

由于臨床中藥處方組方復雜多變，中藥湯劑成分復雜，且其中某些成分具有抑菌作用，如中藥清熱藥多含有綠原酸、小檗堿等抑菌成分，會影響微生物限度檢查準確性。因此，本研究采用天津市中醫藥研究院附屬醫院制劑室已經過微生物限度驗證的中藥制劑處方，處方均已收錄于2016年版《天津市醫療機構制劑規范》[3]，按照該院煎藥室的標準操作規程進行操作，且煎藥室定期進行環境及設備微生物監測，考察代煎中藥湯劑在不同貯藏時間、溫度下微生物變化情況。

古代由于條件所限，湯劑的煎煮及貯藏與現代不盡相同，如古代無冰箱等控溫冷藏設備，湯劑多可能當天煎煮、當天服用，而現代代煎中藥湯劑由于其包裝密封性能良好，多可能將7或14 d湯劑冷藏于冰箱內或陰涼通風處。因此，本研究選擇貯藏方式及溫度分別為冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存和室溫避光(20±5 ℃)儲存；考察的時間點選擇第0，1，3，7，14，21天，進行微生物限度檢測，所監測的溫度及時間覆蓋一般代煎中藥湯劑的貯藏期限。

《中華人民共和國藥典》2020年版四部0181合劑項下定義，合劑系指飲片用水或其他溶劑，采用適宜的方法提取制成的口服液體制劑[1]，與湯劑制備符合，因此本研究選擇合劑項下微生物限度檢驗作為標準。研究結果顯示，在經過微生物檢驗的煎藥環境下，采用密封包裝的代煎中藥湯劑，無論其在冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存或室溫避光(20±5 ℃)儲存，在14 d內其微生物限度均符合《中華人民共和國藥典》2020年版合劑項下微生物限度的要求；但隨儲存時間的延長，其微生物數量呈逐漸增多趨勢，但每個具體處方微生物數量趨勢，并無明顯規律，可能與各處方所含不同飲片和每味飲片在其處方中的比例不同有關，需在后續實驗中具體考察單獨處方的微生物限度變化規律。

綜上所述，由于臨床開具處方豐富多樣，各家中藥湯劑代煎機構煎煮設備、包裝設備、操作和儲存的環境不同，代煎中藥湯劑微生物限度有很多影響因素。對影響代煎中藥湯劑質量的相關因素進行全面控制，能更好地保證代煎中藥湯劑質量穩定。本研究由于條件所限，只考察了已有微生物限度檢驗方法的中藥湯劑，且在操作和環境可控條件下，密封包裝的代煎中藥湯劑的微生物限度，低溫、避光的貯藏條件，更有利于減少代煎中藥湯劑的微生物滋生，保證患者用藥安全。單味飲片煎劑的微生物限度研究、非密封包裝對湯劑微生物限度的影響等，在后續研究中會逐步納入。開展代煎中藥湯劑微生物限度監測的研究，對提高中藥湯劑的質量、患者用藥安全和療效具有重要意義。