血清自噬相關(guān)蛋白7在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌中的診斷價(jià)值

卓傳尚， 馮惠娟， 葉 治， 林 英， 陳 力， 彭 菲， 柳麗娟

福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 福州 350025

肝細(xì)胞癌(HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。國(guó)家癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年新發(fā)肝癌約37萬(wàn)人，約32.6萬(wàn)人死于肝癌，其中94.7%與慢性HBV感染有關(guān)[1-2]。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是改善原發(fā)性肝癌預(yù)后的關(guān)鍵。然而目前尚缺乏原發(fā)性肝癌高敏感度和高特異度的診斷指標(biāo)。自噬是細(xì)胞自我吞噬胞內(nèi)長(zhǎng)壽蛋白或受損細(xì)胞器并通過(guò)溶酶體途徑進(jìn)行的分解代謝過(guò)程，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[3]。近年研究[4-7]顯示自噬在HBV感染和HCC的發(fā)生發(fā)展起重要作用。但目前關(guān)于自噬相關(guān)蛋白在HBV相關(guān)HCC(HBV-HCC)患者血清中的表達(dá)及意義鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)分析HBV-HCC、非HBV相關(guān)HCC(nonHBV-HCC)、慢性乙型肝炎(CHB)和健康對(duì)照者血清自噬相關(guān)蛋白7(ATG7)的表達(dá)水平，探討ATG7對(duì)HBV-HCC的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年6月—2020年12月于本院住院的HCC患者89例。HCC的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》[8]并經(jīng)病理確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：病理類(lèi)型為肝內(nèi)膽管癌或HCC-肝內(nèi)膽管癌混合型者；已接受過(guò)肝移植術(shù)、局部消融、肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、放化療等抗腫瘤治療者；繼發(fā)性HCC患者；同時(shí)伴有其他腫瘤患者。CHB診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[9]。根據(jù)血清是否檢出HBsAg和/或HBV DNA分為HBV-HCC組及nonHBV-HCC 組。選取同期50例CHB患者(CHB組)和20例健康體檢者作為對(duì)照組(HC組)。

1.2 資料收集 收集研究對(duì)象性別和年齡，總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、TBil、DBil、ALT、AST、GGT和ALP等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。另收集HBV-HCC組患者的BCLC分期和腫瘤直徑等病理資料。

1.3 血清ATG7檢測(cè) 所有研究對(duì)象清晨空腹肘靜脈采血，采血后1 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，3000 r/min離心10 min分離血清，-80 ℃冰箱保存。ATG7檢測(cè)前4 h室溫下復(fù)溶。使用上海江萊生物技術(shù)有限公司人ATG7酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(批號(hào)：Aug 2020)進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在加入終止液15 min內(nèi)用PHOMO酶標(biāo)儀(安圖生物，合肥)在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光密度(OD值)，用WPS表格以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并取得多項(xiàng)式公式，根據(jù)多項(xiàng)式公式計(jì)算每個(gè)樣本的ATG7濃度。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：科審2020-029-01。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25～P75)表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。運(yùn)用GraphPad Prism7.0繪制散點(diǎn)圖，采用Medcalc18.11.3繪制受試者工作特征曲線(xiàn)(ROC曲線(xiàn))并比較不同指標(biāo)曲線(xiàn)下面積(AUC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 HCC、CHB及HC 3組比較，男女比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)(表1)。89例HCC患者中，67例(75.28%)血清HBsAg和/或HBV DNA陽(yáng)性，納入HBV-HCC組；剩余22例(24.72%)納入nonHBV-HCC組，包括5例酒精性肝硬化，8例非酒精性脂肪肝，1例慢性丙型肝炎，2例肝硬化(病因未明)，6例慢性肝炎(病因未明)。HBV-HCC組血清TBil水平及具有肝硬化背景病例數(shù)高于nonHBV-HCC組，而nonHBV-HCC組的血清AST水平和最大腫瘤直徑高于HBV-HCC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，其余參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

表1 3組人口學(xué)和實(shí)驗(yàn)室特征比較

表2 HBV-HCC組與nonHBV-HCC組生化和病理特征比較

2.2 HBV-HCC血清ATG7表達(dá)水平升高 HBV-HCC組、nonHBV-HCC組、CHB組和HC組血清ATG7水平分別為22.88(19.79～23.04)ng/mL、17.06(14.45～19.40)ng/mL、19.21(16.65～20.82)ng/mL和13.82(8.70～17.82)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=65.144，P<0.001)。兩兩比較顯示HBV-HCC組血清ATG7不僅高于CHB組(U=758.5，P<0.001)和HC組(U=94.0，P<0.001)，也高于nonHBV-HCC組(U=142.0，P<0.001)；而nonHBV-HCC組血清ATG7水平不僅低于HBV-HCC組，也低于CHB組(U=311.0，P=0.003)，僅稍高于HC組(U=142.0，P=0.049)(圖1)。此外，在67例HBV-HCC患者中，有肝硬化背景和無(wú)肝硬化背景患者的血清ATG7水平分別為22.32(19.79～22.99)ng/mL和20.89(19.40～23.37)ng/mL，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 4組血清ATG7表達(dá)水平比較

2.3 血清ATG7表達(dá)水平和血清AFP水平的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，血清ATG7表達(dá)水平和血清AFP水平呈正相關(guān)，但相關(guān)性較弱(r=0.354，95%CI：0.205～0.486，P<0.001)(圖2)。

圖2 血清ATG7和AFP相關(guān)性分析

2.4 ATG7在HBV-HCC中的診斷性能 ROC曲線(xiàn)分析顯示，ATG7診斷HBV-HCC的AUC為0.818(95%CI：0.743～0.879)，稍高于AFP(AUC=0.777，95%CI：0.698～0.843)，但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.852，P=0.394)(圖3)；ATG7診斷HBV-HCC的cut-off值為20.08 ng/mL，敏感度和特異度分別為71.64%和77.14%，均略高于AFP(68.66%和74.29%)。ATG7聯(lián)合AFP的二元logistic回歸預(yù)測(cè)概率的AUC為0.859(95%CI：0.790～0.913)，顯著高于ATG7(Z=2.192，P=0.028)和AFP(Z=2.076，P=0.038)(圖3,表3)。

3 討論

本研究通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)HCC患者血清ATG7表達(dá)水平，結(jié)果顯示HBV-HCC患者血清ATG7顯著升高，血清ATG7是診斷HBV-HCC的良好標(biāo)志物，ATG7與AFP聯(lián)合診斷可顯著提高HBV-HCC的診斷效率。

表3 ATG7、AFP及其聯(lián)合檢測(cè)診斷HBV-HCC的性能

圖3 ATG7、AFP及二者聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線(xiàn)

ATG7作為一種泛素樣修飾物激活酶，通過(guò)激活A(yù)TG8和ATG12調(diào)節(jié)自噬體的延伸，是自噬體形成過(guò)程的關(guān)鍵蛋白之一[10]。近年研究[11-12]提示ATG7及自噬在HBV-HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。首先，HBV感染或HBV病毒蛋白的表達(dá)可誘導(dǎo)ATG7表達(dá)及自噬反應(yīng)。本研究中CHB組血清ATG7顯著高于健康對(duì)照組，印證了自噬與HBV感染有關(guān)。其次，多項(xiàng)研究[13-14]顯示包括ATG7在內(nèi)的多種自噬相關(guān)蛋白在HCC組織表達(dá)顯著提高。近年的分子細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步揭示多種分子可通過(guò)ATG7調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展[15-17]。研究[15]顯示長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)可通過(guò)上調(diào)ATG7表達(dá)激活自噬促進(jìn)HCC細(xì)胞系增殖。癌性錨蛋白重復(fù)序列可直接與胞質(zhì)中的ATG7蛋白相互作用誘導(dǎo)自噬從而促進(jìn)HCC細(xì)胞進(jìn)展[16]。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8(TNFAIP8 )則通過(guò)與ATG3-ATG7復(fù)合物相互作用調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖[17]。相反，靶向敲減ATG7可抑制自噬，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡、延緩細(xì)胞周期及抑制HCC細(xì)胞增殖[13]。上述研究結(jié)果表明ATG7與HBV-HCC密切相關(guān)。本研究數(shù)據(jù)顯示HBV-HCC患者血清ATG7顯著高于CHB和健康對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了自噬與HBV-HCC的相關(guān)性，提示血清ATG7是一種潛在HBV-HCC標(biāo)志物。而且HBV-HCC患者血清ATG7也顯著高于nonHBV-HCC，提示不同病因的HCC發(fā)病機(jī)制不同，其血清標(biāo)志物也可不同。

雖然AFP已在臨床應(yīng)用數(shù)十年，但診斷敏感度不高。最近的一項(xiàng)系統(tǒng)綜述[18]顯示，AFP診斷HCC的合并敏感度僅為63.9%。與此相符，本研究中AFP診斷HBV-HCC的敏感度、特異度和AUC分別為68.66%、74.29%和0.777。雖然ATG7的敏感度與AFP相仿，但其特異度較高，總體診斷性能較好。此外，ATG7和AFP相關(guān)性較弱，提示二者聯(lián)合檢測(cè)可有效提高診斷性能。早前有學(xué)者[19]提出應(yīng)用logistic回歸分析有助于提高多指標(biāo)聯(lián)合診斷效率。本研究結(jié)果顯示ATG7聯(lián)合AFP的二元logistic回歸預(yù)測(cè)模型對(duì)HBV-HCC的整體診斷性能較好，AUC及診斷敏感度和特異度均顯著高于ATG7及AFP。

總之，本研究顯示ATG7是HBV-HCC的良好標(biāo)志物，與AFP有較好的互補(bǔ)性，二者聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高HBV-HCC的診斷效率。然而本研究為單中心橫斷面研究，納入研究病例有限，因此其診斷性能仍有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本的多中心臨床驗(yàn)證。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：卓傳尚、馮惠娟負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)研究方案，整理數(shù)據(jù)；卓傳尚負(fù)責(zé)論文撰寫(xiě)；馮惠娟、葉治負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)分析；林英、陳力、彭菲負(fù)責(zé)收集標(biāo)本及數(shù)據(jù)；柳麗娟負(fù)責(zé)指導(dǎo)論文撰寫(xiě)與終審論文。