馬兜鈴酸Ⅰ致小鼠急性肝毒性的轉錄組學分析

朱哿瑞， 王 靜， 黃 愷， 彭 淵， 劉成海,， 陶艷艷

1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院 肝病研究所， 上海 201203；2 上海市中醫臨床重點實驗室， 上海 201203

馬兜鈴酸(aristolochic acids，AA)是一種硝基菲類化合物，廣泛分布在馬兜鈴屬和細辛屬植物中[1]，已知的AA類化合物主要有4種，分別為AA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，其中AA Ⅰ為主要毒性成分且毒性最強，AA Ⅱ次之，二者均是引起腎毒性和基因毒性的主要原因[2-3]。AA具有免疫激活、抗炎、腎毒性、致癌性和致突變性等作用[4]，新近研究[5]表明，AA與肝癌密切相關。但AA與肝癌的關系仍有爭議，因此對于AAⅠ導致肝損傷的研究還是十分必要的。

轉錄組學主要從RNA水平研究基因的整體表達情況，是功能基因組學重要的組成部分[6]。隨著高通量測序技術的發展，轉錄組測序技術(RNA-Seq)憑借測序成本低、精度高、覆蓋范圍廣等優點[7]，已成為轉錄組分析的重要方法，為研究基因表達模式、疾病的生物標志物探測等提供了新的手段。本研究采用IIIumina HiSeq X Ten高通量測序平臺，對AAⅠ致小鼠肝損傷進行高通量測序，建立相應的轉錄組數據庫，繼而進行差異表達分析以及GO、KEGG富集分析，并以實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證本轉錄表達的可靠性，以進一步明確AAⅠ致肝毒性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物 C57BL/6雄性小鼠15只，體質量23～25 g，SPF級，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0010；動物使用許可證號：SYXK(滬)2019-0003。按照SPF級動物飼養要求進行飼養。

1.2 試驗藥物 AAⅠ (批號：3503)，購自上海詩丹德標準技術服務有限公司，純度>98.5 %；羧甲基纖維素鈉(批號：F20051103)，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試劑 ALT試劑盒(批號：20130110)、AST試劑盒(批號：20130411)，購自南京建成生物工程研究所；Trizol Reagent (批號：F919KB3054)、總RNA提取試劑盒(批號：B518811)，購自上海生工生物工程股份有限公司；反轉錄試劑盒(批號：AJ92014A)、擴增試劑盒(批號：AJF0343A)，購自日本TAKARA公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及模型建立 小鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組(n=6)和處理組(n=9)。處理組小鼠以AA Ⅰ 20 mg/kg劑量連續腹腔注射，1次/d，連續5 d，正常組小鼠注射相同容積的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液。

1.4.2 藥物配置 100 mg羧甲基纖維素鈉溶解于20 mL雙蒸水中配置成0.5%的混懸液。40 mg AAⅠ加入20 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液中制備成2 mg/mL貯存液，超聲震蕩至完全溶解，4 ℃保存備用。

1.4.3 樣本采集 小鼠以3%戊巴比妥鈉麻醉、固定，打開腹腔、下腔靜脈取血，用于測定血清ALT、AST。肝右葉切割0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm大小固定于4%甲醛固定液中，用于HE染色；另取100 mg肝組織存于Trizol中用于提取RNA。

1.4.4 指標測定 按試劑盒說明書測定血清中ALT、AST水平。

1.4.5 肝組織HE染色 肝組織經4%中性甲醛緩沖液固定，自動脫水機脫水，石蠟包埋，4 μm切片，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光學顯微鏡(Olympus 1×70，Japan)觀察并拍照。

1.4.6 肝組織轉錄組測序 提取肝組織總RNA，采用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara)進行質量檢測；Qubit 2.0 RNA檢測試劑盒測定RNA濃度，包括mRNA分離/片段化、雙鏈DNA合成、末端修復、末端dA-Tailing、橋頭連接、連接產物純化和片段大小分選及文庫擴增等；利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒精確定量回收的DNA，按1∶1比例定量混合，使用IIIumina HiSeq X Ten 測序儀進行測序，產生150 bp的雙端數據。建庫測序由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。

1.4.7 基因質量控制 使用Trimmomatic (Version 0.36)軟件進行質控并去除接頭，在此基礎上過濾掉低質量堿基以及N堿基，最終得到高質量的cleanreads。利用hisat2 (Version 2.2.1.0)軟件將Clean Reads與小鼠參考基因組(從NCBI中下載參考基因組，基因組版本為GRCm38.p6)進行序列比對，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，以及測序樣品特有的序列特征信息。各樣本的有效數據量分布在 5.99～6.83 G，Q30 堿基分布在 93.97%～95.01%，平均GC含量為47.90 %。通過將reads比對到參考基因組上，得到各個樣本的基因組比對情況，比對率為92.6%～98.23%。

1.4.8 差異表達基因篩選 導出各樣本測序結果，通過R語言軟件的“Affy”“limma”包對數據分析差異表達基因，將篩選條件設為P.Value<0.05、adj.P.Value<0.05、logFC>2，獲取上調和下調的差異基因。Pheatmap包繪制熱圖和火山圖。

1.4.9 差異表達基因的GO和KEGG富集分析 得到差異表達基因后，采用R語言的“clusterProfiler”“org.Mm.eg.db”“enrichplot”“colorspace”“stringi”“ggplot2”包對差異表達基因進行GO和KEGG富集分析。設置篩選條件為P.Value Cutoff <0.05和Q.Value Cutoff<0.05，并計算生物學過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、細胞組分(cellular component, CC)功能上的基因富集數，最后將排名前20的GO生物過程和KEGG通路，繪制成氣泡圖。

1.4.10 差異表達基因的qRT-PCR驗證 基于轉錄組差異基因結果，選擇變化最顯著基因進行qRT-PCR驗證。使用NCBI在線引物設計軟件Primer-Blast設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成(基因名稱、引物序列見表1)。Trizol提取肝組織總RNA，采用試劑盒進行逆轉錄，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光染料法實時定量試劑盒說明進行cDNA擴增，每個樣品重復3次。以β-actin為內參，采用2-△△CT法進行分析定量。

表1 基因引物序列

1.5 倫理學審查 所有操作均由上海南方模式生物科技股份有限公司實驗動物管理和使用委員會(IACUC)審批通過，批號：IACUC號2018-0026。

2 結果

2.1 小鼠體質量變化 正常組小鼠體質量逐漸增加，AAⅠ染毒過程中，處理組小鼠體質量逐步下降，造模至第4天，體質量下降明顯(圖1)。

圖1 兩組小鼠體質量變化

2.2 小鼠肝功能以及肝組織學的比較 與正常組相比，處理組小鼠血清ALT、AST水平分別升高7倍和4倍(表2)，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。HE染色可見，正常組肝組織小葉結構完整，肝細胞排列整齊、無壞死；處理組肝小葉結構紊亂、肝細胞胞漿疏松、小葉內可見點狀壞死(圖2)。表明20 mg/kg AA Ⅰ 給藥5 d可造成明顯肝損傷。

表2 兩組小鼠血清ALT、AST水平的比較

圖2 正常組與處理組小鼠肝組織切片(HE染色，×100)

2.3 差異表達基因的篩選結果 通過R語言中的Affy包去除原始數據中系統誤差，得到標準化的基因表達數據。通過R語言中的Limma包對肝損傷組織和正常組織標準化之后的數據進行差異表達分析，最終1352個基因達到篩選標準(P<0.05且|logFC|>2)，其中有703個上調基因，649個下調基因。利用R語言中的pheatmap包繪制差異顯著的前20個上調基因和前20下調基因的熱圖，直觀的顯示出差異表達基因(附錄1)。

熱圖(附錄1a)顯示出多個基因在兩組中的表達水平。與正常組相比，處理組主要有以下基因發生差異性表達：Srd5a1、Lipc、Aqp8、Hba-a1、Slco1a1、Pklr、keg1、Nudt7等。其中，下調基因最明顯前6位分別為Srd5a1、Lipc、Aqp8、Hba-a1、Slco1a1、Pklr。火山圖(附錄1b)用于展示基因表達差異的分布，其中橫軸為FC的對數，越偏離中心FC越大；縱軸為差異顯著性P值的負對數，值越大表明差異越顯著。

2.4 差異表達基因的GO功能富集分析 為進一步了解差異表達基因的功能，陳述其在分子水平上的作用，針對差異表達基因進行GO注釋(附錄2)。Gene Ratio表明差異基因中與該Term相關的基因數與差異基因總數的比值，圓圈大小代表基因的多少，qvalue為對P值進行統計學檢驗的q值，qvalue值越小說明富集程度越明顯。結果表明，小分子分解代謝(small moleculle catabolic process)、中性粒細胞參與的免疫應答(neutrophil activation involved inimmune respond)、分泌顆粒細胞質囊泡腔(secretory granule lumen)、細胞質囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、細胞外結構組織(extracellular structure organization)、細胞外基質組織(extracellular matrix organization)等相關的GO分類呈顯著富集。

2.5 差異表達基因的KEGG富集分析 對正常組和處理組變化最明顯的40個差異基因進行KEGG富集分析(附錄3)，其中富集因子(enrichment Score, ES)代表基因的富集程度，X軸為富集分數，氣泡越大的條目包含的差異蛋白編碼基因數目越多，氣泡顏色由紫-藍-綠-黃-紅變化，其富集P值越小，顯著程度越大。

結果表明，化學致癌(Chemical carcinogenesis)、視黃醇代謝(Retinol metabolism)、花生四烯酸代謝(Arachidonic acid metabolism)、類固醇激素合成(Steroid hormone biosynthesis)、癌癥中的轉錄失調(Transcriptional misregulation in cancers)、蛋白質消化和吸收(Protein digestion and absorption)、炎癥介質對TRP通道的調節(Inflammatory mediator regulation of TRP channels)、藥物代謝(Drug metabolism)、補體和凝血級聯(Complement and coagulation cascades)、谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)等在KEGG通路中顯著富集。

2.6 差異表達基因的qRT-PCR驗證 在表達的差異基因中挑選5個差異基因，以β-actin為內參，采用qRT-PCR驗證RNA-seq的可靠性(圖3)。結果發現，與正常組相比，處理組Srd5a1、Lipc、Aqp8、Hba-a1、Slco1a1、Pklr 6個基因表達水平顯著減少(P值均<0.05)。

3 討論

自從20世紀90年代確認AA具有腎毒性以來[8]，已有部分藥材被禁用；但由于部分含AA藥物的不可替代性，仍然應用于臨床。研究證實AA可導致腫瘤的發生。AA和馬兜鈴藥材已被世界衛生組織國際癌癥研究機構、美國食品藥品監督管理局等列為Ⅰ類致癌物[9-10]。近年來關于AA與肝癌的研究[11]屢見不鮮，然而，AA的腎臟毒性已被學界廣泛認可，但是AA引起的肝損傷，尤其是AA能誘發肝癌的說法有著很大的爭議，其具體機制還需進一步探討。

AAⅠ灌胃5 d，小鼠血清ALT、AST分別升高7倍和4倍，且肝組織病理結果顯示肝小葉結構紊亂、肝細胞胞漿疏松、小葉內可見點狀壞死，這提示AAⅠ可引起小鼠急性肝損傷。進一步提取肝組織RNA進行高通量轉錄組測序，發現正常組與處理組的差異基因數目為1352個；其中，表達上調的基因有703個，下調的基因有649個。差異基因中下調最明顯前6位分別為Srd5a1、Lipc、Aqp8、Hba-a1、Slco1a1、Pklr。再采用qRT-PCR檢測，與正常組相比，處理組Srd5a1、Lipc、Aqp8、Hba-a1、Slco1a1、Pklr的基因表達均明顯降低，與轉錄組測序結果一致。

Srd5a(5-α-Reductase)是類固醇5α-還原酶，能將睪酮還原為雙氫睪酮，從而調節激素水平和腫瘤的發生與發展。SRD5A具有3種亞型分別為Srd5a1、Srd5a2和Srd5a3[12]。Srd5a1廣泛分布于人體，如皮膚、肝臟、腎臟、免疫組織和神經組織等，它與多種系統疾病有關。Srd5a1的異常會造成局部或全身雄激素水平紊亂。近年來有研究報道，Srd5a1在前列腺癌[12]、乳腺癌[13]、非小細胞肺癌[14]和肝癌[15]中均表達升高。肝脂肪酶(LIPC,又稱HL)，由肝實質細胞合成，可以水解脂蛋白中的甘油三酯和磷脂，從而促進它們的清除和代謝[16]。LIPC基因位于15號染色體長臂 (15q21)，全長35 kb, 由9個外顯子和8個內含子構成, 編碼由449個氨基酸組成的蛋白質[17]。LIPC的多態性及基因突變可導致血脂異常。Homanics等[18]發現，小鼠的LIPC缺乏會產生輕度血脂異常，包括總膽固醇、磷脂和高密度脂蛋白膽固醇的增加。水通道蛋白-8(AQP8)是哺乳動物水通道蛋白家族的成員之一，能促進水和某些小溶質在生物膜上的運動[19]，其在消化系統中廣泛表達，包括小腸、結腸、胰腺和肝臟等[20]。AQP8在肝細胞中具有廣泛的生理功能，其表達缺乏易引起肝功能紊亂。Jablonski等[21]研究證實肝細胞癌的發生與AQP8表達降低和質膜水滲透性降低有關。Slco1a1，又名OATP1，是屬于溶質載體超家族(solute carrier, SLC)的一種跨膜蛋白[22]，OATP1的表達在肝炎、肝硬化中表達下調[23-24]。PKLR是丙酮酸激酶(pyruvate kinase， PK)的基因編碼。PK是催化糖酵解的關鍵酶，用于催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，同時使ADP磷酸化而生成ATP[23]。PK有4種亞型。其中的PKM2已經被證實在肝癌細胞中顯著增加，在糖酵解的調控中起關鍵作用[25]。有研究[26-27]報道，PKLR主要通過增加內源性抗氧化劑谷胱甘肽來促進腫瘤核心的細胞存活，負調節PKM2的糖酵解活性，并介導結腸癌在肝臟定植。上述基因在AAⅠ引起的急性肝損傷中鮮有報道。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 正常組與處理組差異表達基因qRT-PCR分析

差異基因中，上調最為明顯的為LCN2、MT1和MT2。LCN2是一個25 kDa的小分子、分泌性蛋白[28]。在LPS和ConA誘導的肝損傷模型中明顯升高[29]。在膽管炎癥或肝臟炎癥時，血液和肝臟中LCN2水平明顯升高[30]，同時也與肝衰竭和全身炎癥反應相關，是慢加急性肝衰竭及預后的生物標志物[31]。MT1及MT2是金屬硫蛋白(MTs)的亞型，在細胞、組織均有表達，以肝、腎最為豐富[32]。研究[33]報道MT對急性化學性肝損傷有一定的保護作用。在由鎘、四氯化碳或對乙酰氨基酚引起的急性肝毒性中，可通過清除氧自由基對肝臟起到保護作用。

本研究通過高通量測序技術，從基因轉錄水平初步揭示了AAⅠ致急性肝毒性機制。并采用qPCR驗證了下調最明顯的6個基因，提示轉錄組學的可靠性。本研究中轉錄組學揭示的AAⅠ肝毒性的基因及相關信號通路有待進一步深入研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：朱哿瑞負責資料分析，撰寫論文；王靜、黃愷、彭淵負責修改論文；劉成海指導課題設計、修改論文；陶艷艷負責擬定課題設計和寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

附錄1～3見二維碼