利用CRISPR/Cas9技術建立OXTR基因敲除豬胎兒成纖維細胞系

劉靜靜 劉曉蕊 李琳 王盈 楊海元 戴一凡

（南京醫科大學江蘇省異種移植重點實驗室，南京 211166）

自閉癥是一種嚴重的神經發育疾病，臨床表現為社會交往障礙、語言交流障礙和刻板重復的行為方式［1］。自閉癥致殘率較高，且患病率有逐年增長的趨勢，但尚未開發出特異性的治療藥物，給患者和社會帶來沉重的負擔。自閉癥病因和發病機制十分復雜，目前受到關注最多的是催產素系統假說。催產素是一種具有高度保守結構的神經肽，大量的動物實驗表明它與情感反應和社會認知等社會行為有關。催產素的生理作用是通過其唯一的受體OXTR來介導的。人類催產素受體（OXTR）屬于I類G蛋白偶聯受體，位于3p25-3p26.2，由3個內含子和4個外顯子組成［2］。催產素受體分布在杏仁核、紋狀體、海馬等調節社會認知的重要區域［3-4］。OXTR基因變異可引起大腦結構改變并與社會行為相關聯，如下丘腦和杏仁核的病變以及社交缺陷等［5-8］。研究表明OXTR基因變異與自閉癥存在相關性，但催產素受體影響自閉癥的分子機制還不明確。

OXTR基因敲除的動物模型是揭示OXTR生理功能的重要工具。目前，已有OXTR基因敲除的小鼠、斑馬魚被用于自閉癥相關行為缺陷的研究［9-10］，但它們存在社交信號（發聲、面部表情）和大腦活動模式有限等缺陷［11］。選擇更理想的自閉癥動物模型顯得尤為迫切。豬和人生理特征和解剖結構更為相近，基因組大小相近、基因數量和結構類似［12-13］。豬大腦回旋類似于人的新皮質且它們灰質和白質的分布相似［14-15］。此外，豬的快速繁殖期（性成熟5-6個月）和大窩產仔數（平均7-8頭仔豬），在構建人類疾病模型方面比非人類靈長類動物具有明顯優勢。然而，目前還未見OXTR基因敲除豬報道，限制了在豬上開展關于OXTR對于社會認知影響的實驗研究。

近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術的不斷發展極大推動了創建基因編輯豬疾病模型的研究［16-17］。本研究利用CRISPR/Cas9技術構建OXTR基因敲除的巴馬公豬PFFs細胞系，為構建OXTR基因編輯豬模型進而深入研究遺傳性自閉癥的發病機制和防治策略奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原代巴馬豬胎兒成纖維細胞由本組實驗室提取培養。DH5α感受態細胞和質粒抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，pX330質粒（Addgene 42230）、Bbs I限制性內切酶、T4 DNA連接酶均購自美國New England Biolabs 公司，細胞電轉儀購自德國Lonza公司，DMEM培養液、胎牛血清、G418藥物均購自美國Gibco 公司，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人/豬OXTR的同源性分析 通過NCBI數據庫查找并下載人和豬等多個物種的OXTR的氨基酸序列，利用MEGA-X軟件中鄰接法（neighbor-joining method）構建系統進化樹，自展分析1 000次用于檢測系統進化樹的穩定性。在線工具 iTOL（https://itol.embl.de/）進一步繪制系統進化樹。

1.2.2 人/豬OXTR的結構分析 采用DNAMAN軟件、DNASTAR軟件對人/豬OXTR的一級、二級結構進行分析，使用BLAST中的Global Align程序計算一致性和相似性，Chou-Fasman算法預測人/豬OXTR的α螺旋、β折疊、β轉角的比例。接著利用Swiss Model在 線 工 具（https://www.swissmodel.expasy.org/）對人/豬OXTR三維結構進行建模，采用PyMOL軟件比較兩者蛋白結構的相似度。

1.2.3 豬OXTR關鍵殘基和結構域的鑒別 利用NCBI當中的CD-search工具搜索鑒定豬OXTR關鍵殘基和結構域。輸入豬OXTR氨基酸序列，同時在右方OPTIONS中選擇數據庫選擇具有保守結構域數據庫（conserved domain database，CCD庫），提交完成后搜索匹配結果。

1.2.4 sgRNA靶點設計 根據GenBank中公布的豬的OXTR基因序列（NC_010455.5），設計引物（表1），并提取巴馬豬PFFs基因組DNA進行PCR擴增，測序驗證是否與公布的基因序列相符。利用在線工具CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）針對第2外顯子區篩選關鍵靶向位點，設計Oligo合成。

表1 OXTR基因exon 2序列擴增引物Table 1 Amplification primers for exon 2 sequene of OXTR gene

1.2.5 CRISPR/Cas9打靶載體構建 用T4 DNA連接酶將Oligo退火形成的雙鏈二聚體與Bbs I酶切的pX330骨架質粒連接，轉化入DH5α感受態細胞，均勻涂布于Ampicillin抗性的LB瓊脂培養板上。挑取單菌落進行測序鑒定，擴增鑒定連接成功的菌液，并用質粒抽提試劑盒提取。

1.2.6 細胞轉染 復蘇凍存的野生型巴馬豬原代PFFs，用細胞培養液培養至細胞長滿皿底90%左右轉染。利用核轉染儀將打靶載體1 μg及Neomycin抗性質粒（由本實驗室構建）2 μg共轉染至野生型PFFs，核轉染程序設定U-023。

1.2.7 單細胞克隆的篩選與鑒定 轉染24 h后，用含有G418藥物的完全培養液培養10 d左右，可見G418抗性單細胞克隆形成。用克隆環挑選狀態佳的單克隆，轉移至24孔板。第2天用含G418的培養液培養，直至細胞長滿皿底，胰酶消化并傳代至12孔板，待12孔板中的細胞長滿后，即可凍存備用；遺留在24孔板中的細胞長滿后用NP40裂解，裂解程序60℃，60 min；95℃，10 min，以裂解產物為模板PCR，并將產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

2 結果

2.1 人/豬OXTR生物信息學分析

系統進化樹分析顯示，豬的OXTR進化距離與人接近（圖1）。經DNAMAN比對分析，人/豬OXTR氨基酸序列高度一致（一致性/Identity=91%；相似性/similarity=93%）（圖2-A）。利用DNASTAR軟件Protein模塊中對人和豬OXTR的二級結構進行分析，Chou-Fasman算法預測人OXTR的α螺旋占30.3%，β折疊占40.6%，β轉角占21.6%，豬OXTR的α螺旋占42.2%，β折疊占37.7%，β轉角占19.3%（圖2-B）。人和豬OXTR具有相似排布和占比的α螺旋、β折疊、β轉角。而人和豬OXTR三維建模顯示也具有極高相似度的三維空間排列，RMSD值為0.009（圖2-C）。以上生物信息學分析表明，人/豬OXTR序列和結構具有高度的同源一致性，推測人/豬OXTR具有相似的生物學功能。

圖1 不同物種OXTR序列構建的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of OXTR sequences of different species

圖2 人/豬OXTR的一級、二級、三級結構分析Fig.2 Analysis of primary，secondary，and tertiary structures of OXTR between humans and pigs

2.2 豬OXTR關鍵結構域的鑒別和靶點區域的選擇

在CD-search的CDD分析中，鑒別出豬OXTR的7個α螺旋結構域，分別是41-67，74-101，112-142，152-173，197-226，270-300，310-335間的氨基酸殘基（圖3）。研究發現，人類OXTR的7個α螺旋結構域中，第2-5個跨膜結構域與底物的相互作用有關，其中第2個跨膜結構域還與受體的激活相關［18］。豬OXTR的第2-5個跨膜結構域由豬OXTR的第2外顯子編碼。因此，本研究選擇豬OXTR的第2外顯子作為敲除的靶點位置。

圖3 豬OXTR關鍵殘基和結構域的鑒別Fig. 3 Identification of domains and key residues of porcine OXTR

2.3 CRISPR/Cas9打靶載體的構建

針對巴馬豬OXTR基因第2外顯子序列，設計了2對sgRNA oligos（表2、圖4-A）。測序結果顯示，Oligo退火形成的雙鏈sgRNA-1、sgRNA-2成功插入線性化的pX330骨架質粒中（圖4-B-D），并用試劑盒成功提取打靶載體質粒。

圖4 OXTR基因靶點和重組載體測序Fig.4 Target of OXTR gene and sequencing of recombinant vectors

表2 OXTR基因靶向位點的sgRNA寡核苷酸序列Table 2 Oligonucleotide sequences of sgRNAs at OXTR targeting sites

2.4 OXTR基因敲除細胞系的鑒定

將靶向豬OXTR的CRISPR/Cas9質粒和Neomycin抗性表達載體共轉染豬胎兒成纖維細胞，通過G418（1 mg/mL）篩選，獲得到了抗性的單克隆細胞系。提取抗性的單克隆細胞的基因組DNA，PCR擴增OXTR靶點區域片段后進行測序，并與野生型豬OXTR基因序列進行比對。結果顯示共獲得了5個純合的OXTR雙等位基因敲除的細胞克隆，其基因型可分為3種類型，在OXTR的靶點區域產生了411 bp的缺失（mutant type 1），412 bp的缺失（mutant type 2），289 bp的缺失和289 bp的插入（mutant type 3）（圖5，表3）。

表3 OXTR 敲除PFFs的基因型Table 3 Genotypes of OXTR-knockout PFFs

圖5 OXTR敲除PFFs的測序結果Fig.5 Sequencing results of OXTR-knockout PFFs

3 討論

自閉癥是一種極其復雜的疾病，與遺傳、環境等多種因素密切相關。雙生子研究證實遺傳因素是影響自閉癥的重要因素［19］。全基因組測序確定OXTR基因是自閉癥的候選基因［20］。催產素受體作為神經通路的重要環節，其異常可能造成細胞內鈣離子濃度變化，導致神經元功能受損，進而影響社會認知功能［21］。因此，OXTR基因與自閉癥存在高度相關性。由于自閉癥涉及多種復雜的高級神經活動，要為自閉癥研究和治療提供更有利支持，更高級的OXTR基因敲除動物模型非常必要。豬被認為是理想的人類疾病動物模型，因此，本研究選擇用豬胎兒成纖維細胞的OXTR基因進行編輯。

豬OXTR基因位于第13號常染色體上，生物信息學分析提示，豬OXTR基因突變后可能產生和人類似的遺傳效應和病理表型。sgRNA原則上可以設計在任何外顯子區域，對目標序列進行切割，通過DNA自身修復機制引入突變導致基因的敲除。由于在OXTR受體基因的5′上游區域存在許多轉錄因子結合位點，這些位點在調節受體轉錄發揮主要作用［22］，結合對豬OXTR關鍵結構域的分析，本研究在第2外顯子選擇靶基因的識別序列，設計并合成sgRNA。CRISPR/Cas9優勢在于操作簡單、實驗周期短、成本低。本課題組已利用此技術成功構建色氨酸羥化酶2（Tph2）基因敲除豬、OSBPL2敲除豬等［23-24］，驗證了CRISPR/Cas9技術在豬基因組修飾上的有效性。我們前期研究中選擇單個sgRNA進行基因打靶，獲得的細胞克隆多數為靶點區域產生小片段插入缺失，且敲除的效率相對較低［25］。本研究設計2個靶向OXTR的sgRNA進行打靶。結果顯示，5個OXTR雙等位基因敲除的單細胞克隆均在預期的靶點位置發生了大片段的堿基缺失或插入，確保OXTR蛋白被完全破壞，表明利用2個sgRNA同時進行基因打靶能夠顯著提高基因敲除的效率。

據世界衛生組織估計，全球自閉癥病患病率為6.25%，男性患病率約為女性的4倍。我們推測OXTR突變的雄性巴馬豬更有可能出現自閉癥的病理表型，因此本研究中我們僅對雄性的巴馬豬胎兒成纖維細胞進行了OXTR基因的打靶。本研究中獲得的OXTR基因敲除的巴馬豬胎兒成纖維細胞后續將用作SCNT（somatic cell nuclear transfer）的核供體細胞，通過胚胎移植構建OXTR敲除巴馬豬疾病動物模型。

4 結論

本研究基于CRISPR/Cas9基因編輯工具在巴馬公豬成纖維細胞系上高效實現了OXTR基因的打靶，成功構建了OXTR基因敲除的成纖維細胞系，為建立OXTR敲除的豬模型提供了實驗材料。