山藥多糖對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

王靜，韓瑩，連珺怡，孫玉姣，劉歡，陳雪峰

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710021)

丙烯酰胺(acrylamide, AM, C3H5NO)是一種食品高溫加工時(shí)生成的有害物質(zhì)，常見于煎炸、燒烤、烘焙食品，如薯片、面包、咖啡、餅干、油條、油炸堅(jiān)果及谷類等[1]。AM也是一種常用的工業(yè)原料，長期以來被廣泛應(yīng)用于飲用水和工業(yè)廢水處理、石油開采、造紙、紡織、黏合劑、染料、化妝品生產(chǎn)等領(lǐng)域?，F(xiàn)實(shí)生活中，人們暴露于AM主要是通過接觸AM污染的大氣、水源、物品，以及食用含有AM的食品等[2]。AM可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑進(jìn)入生物體內(nèi)產(chǎn)生致癌性、神經(jīng)毒性、遺傳毒性、生殖毒性及心臟發(fā)育毒性，還能干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)[3-4]。不僅如此，近年來有研究顯示AM對(duì)免疫系統(tǒng)也有潛在危害。AM染毒后，大鼠的陽性外周血淋巴細(xì)胞數(shù)、胸腺細(xì)胞數(shù)和脾細(xì)胞減少，Th/Ts比例失調(diào)，自然殺傷細(xì)胞失活。染毒小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能下降，脾臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性降低。AM還可以通過線粒體氧化應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞凋亡[5-7]。美國流行病學(xué)研究指出AM誘導(dǎo)的哮喘、發(fā)燒、打噴嚏和濕疹等過敏類似反應(yīng)可能也與AM導(dǎo)致的免疫缺陷有關(guān)[8]。免疫系統(tǒng)功能與人類健康息息相關(guān)。因此，控制AM的免疫毒性對(duì)維持機(jī)體健康具有重大意義。

活性多糖被譽(yù)為人體“第七營養(yǎng)素”，大量研究證實(shí)其具有優(yōu)良的調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒、降血壓、降血脂、降血糖、抗衰老、抗輻射、保護(hù)肝腎等作用。多糖的安全性高，在食品和保健品等領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價(jià)值。活性多糖的研究開發(fā)一直受到國內(nèi)外各行業(yè)的密切關(guān)注，是學(xué)界的熱門領(lǐng)域。而多糖在免疫機(jī)制方面的研究進(jìn)展迅速，已由一般性的觀察發(fā)展到分子水平，其中以多糖免疫功能對(duì)巨噬細(xì)胞的影響尤為突出[9]。山藥是一種食用和保健價(jià)值很高的天然食品資源。我國山藥資源豐富，在陜西、河南等省份廣泛種植。近來，在農(nóng)業(yè)科技強(qiáng)農(nóng)和脫貧致富政策的帶動(dòng)下，許多地區(qū)也開始了大面積種植。山藥營養(yǎng)價(jià)值豐富，山藥多糖(Rhizomadioscoreaepolysaccharides, RDPS)是山藥的重要功能活性成分，目前已有報(bào)道顯示山藥多糖具有良好抑菌活性[10]和降脂、降血糖作用[11-13]，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[14]，促進(jìn)正常細(xì)胞如人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的生長[15]。此外，山藥多糖還可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能[16]，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性，但山藥多糖能否有效干預(yù)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷，未見報(bào)道。因此，本研究以AM誘導(dǎo)小鼠免疫細(xì)胞-巨噬細(xì)胞損傷，山藥多糖干預(yù)AM的毒性，探究山藥多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用，研究結(jié)果將為揭示山藥多糖調(diào)節(jié)免疫的作用機(jī)制提供理論依據(jù)；對(duì)促進(jìn)山藥多糖的深入開發(fā)應(yīng)用，以及控制AM毒性都具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞，中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

山藥多糖(UV≥90%)，武漢瓊格生物科技有限公司；AM，美國Amresco公司；DMEM 培養(yǎng)基，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Zeta Life公司；青鏈霉素混合液(100×)、EDTA-胰蛋白酶消化液、中性紅染液(1 mg/mL)，美國Solarbio公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)、小牛胸腺DNA、卵磷脂，北京索萊寶科技有限公司；DAPI染色液，碧云天生物技術(shù)研究所；SOD、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、MDA測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；1，10-鄰菲羅啉鹽酸鹽(Phen)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA),上海山浦化工有限公司；2-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA),上海源葉生物有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan flash全波長掃描式多功能酶標(biāo)儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；IX71熒光倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；小型垂直電泳儀，美國Bio-Rad公司；KQ3200E 超聲清洗儀，蘇州昆山市超聲儀器有限公司；5415D 離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基(含胎牛血清10%、雙抗1%,均為體積分?jǐn)?shù))，在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 AM誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷模型的建立

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，以8×103個(gè)/孔接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，AM誘導(dǎo)試驗(yàn)組每孔加入100 μL以無血清培養(yǎng)基配制的AM溶液(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L)，空白組加入等體積無血清培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后，吸出舊培養(yǎng)基，每孔中加入100 μL MTT工作液(0.5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄上清液，加入200 μL DMSO，置于100 r/min搖床，10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定OD值。細(xì)胞活力按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A0為空白組平均OD值，A1為試驗(yàn)組平均OD值。

1.3.3 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞生長活力的影響

選取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以8×103個(gè)/孔接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，棄去上清液，空白組及AM誘導(dǎo)試驗(yàn)組，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基；山藥多糖預(yù)處理試驗(yàn)組，山藥多糖單獨(dú)處理試驗(yàn)組加入等體積無血清培養(yǎng)基配置的多糖溶液(25.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/mL)。細(xì)胞置培養(yǎng)箱孵育4 h后，山藥多糖預(yù)處理試驗(yàn)組及AM誘導(dǎo)試驗(yàn)組棄上清液加入100 μL AM溶液(4.0 mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，按1.3.2方法計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3.4 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬活力的影響

RAW264.7的吞噬能力可以通過其吞噬中性紅的能力進(jìn)行衡量。按1.3.3對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)及處理。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基并向孔中加入100 μL的中性紅試劑(1 mg/mL)。10 min后，去除多余中性紅并用 PBS洗滌2遍，加入200 μL細(xì)胞裂解液[V(乙醇)∶V(冰乙酸)=1∶1]在室溫下裂解1 h后利用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處的OD值。吞噬活性按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A0為空白組平均OD值，A1為試驗(yàn)組平均OD值。

1.3.5 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

細(xì)胞培養(yǎng)基中SOD及MDA水平的測(cè)定：按1.3.3對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)及處理后，依據(jù)相應(yīng)試劑盒方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中的SOD及MDA含量。

細(xì)胞中ROS水平的測(cè)定：按1.3.2處理細(xì)胞后，細(xì)胞以PBS洗滌2次，加入10 μmol/L的DCFH-DA(用無血清培養(yǎng)基配制)37 ℃孵育20 min，棄去培養(yǎng)基并用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，加入200 μL/孔無血清培養(yǎng)基，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6 山藥多糖對(duì)生物大分子氧化損傷的影響

參照WANG等[17]的方法分別建立BSA損傷模型，DNA損傷模型及脂質(zhì)氧化損傷模型。

山藥多糖對(duì)BSA氧化損傷保護(hù)活性的測(cè)定：采用SDS-PAGE檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的山藥多糖對(duì)蛋白氧化損傷的抑制作用。于1.5 mL離心管中加入40 μL BSA (0.5 mg/mL)與10 μL不同質(zhì)量濃度的山藥多糖溶液(2.5、5.0、25.0、50.0 μg/mL)混合，37 ℃水浴10 min。后加入10 μL CuSO4(1.0 mmol/L)，10 μL H2O2溶液(2.5 mmol/L)并設(shè)置正常對(duì)照組，損傷對(duì)照組。繼續(xù)37 ℃處理90 min，加上樣緩沖液處理后，即可上樣電泳。電泳條件：濃縮膠中電壓80 V、10 min；分離膠中電流電壓120 V、2 h。電泳完成后，凝膠以考馬斯亮藍(lán)法染色，染色后于脫色液中脫色30 min，利用Scion Image軟件拍照并分析條帶。

山藥多糖對(duì)羥自由基(·OH)引發(fā)的DNA損傷的防護(hù)作用：于1.5 mL離心管中加入100 μL不同質(zhì)量濃度的山藥多糖溶液(2.5、5.0、25.0、50.0 μg/mL)及20 μL DNA(3.0 mg/mL)混勻，37 ℃水浴處理10 min。10 min試驗(yàn)組后依次加入10 μL CuSO4(1.0 mmol/L)、22.8 μL Phen(1.75 mmol/L)、20 μL 維生素C(17.5 mmol/L)，用Tris-HCl(pH 7.0, 10.0 mmol/L)緩沖液補(bǔ)足200 μL同時(shí)設(shè)損傷對(duì)照組(無山藥多糖)、空白組(無山藥多糖和誘導(dǎo)損傷試劑)，37 ℃水浴30 min，然后加入200 μL TBA(1 g/100mL)和200 μL TCA(28 g/100mL)，100 ℃加熱10 min，冷卻后利用酶標(biāo)儀測(cè)定532 nm處OD值。抑制率按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：A0為空白組平均OD值，A1為試驗(yàn)組平均OD值，A2為損傷對(duì)照組平均OD值。

山藥多糖對(duì)脂質(zhì)氧化損傷保護(hù)活性的測(cè)定：在1.5 mL離心管中依次加入40 μL脂質(zhì)體液體，80 μL不同質(zhì)量濃度山藥多糖溶液，混勻，加入10 μL FeSO4(50.0 mmol/L)，設(shè)置損傷組，空白對(duì)照組，以PB緩沖液補(bǔ)足600 μL。3組同時(shí)置于37 ℃水浴中溫育40 min，每5 min振搖1次。溫育完成后，每管加入TCA (10 g/100mL)、TBA(0.8 g/100mL)各200 μL，混勻，于100 ℃水浴15 min，冷卻后取上清液用酶標(biāo)儀測(cè)定532 nm處OD值。抑制率同按公式(3)計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

使用Origin 9.0和SPSS 11軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用組間方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小差異顯著法進(jìn)行顯著性比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞生長活力的影響

首先以不同濃度AM(0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L)處理RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h，構(gòu)建AM誘導(dǎo)損傷模型，結(jié)果如圖1所示，與未加AM的對(duì)照組相比，不同濃度AM作用下的巨噬細(xì)胞活力明顯下降，并且隨AM濃度的增加，巨噬細(xì)胞活力呈逐步遞減趨勢(shì)。以2.0 mmol/L的AM處理后細(xì)胞活力和對(duì)照組相比即有顯著差異。當(dāng)AM濃度增加至4.0 mmol/L時(shí)，細(xì)胞活力降至55.3%，6.0 mmol/L濃度處理后，細(xì)胞活力不足30.0%。AM的半數(shù)抑制濃度為4.9 mmol/L(y=-10.551 27x+101.616 82，R2= 0.938 77)。結(jié)果表明，AM對(duì)巨噬細(xì)胞活力的抑制作用具有濃度依賴性，模型構(gòu)建成功，但是考慮到后續(xù)試驗(yàn)的干預(yù)效果，結(jié)合半數(shù)致死量，選擇4.0 mmol/L構(gòu)建巨噬細(xì)胞損傷模型，進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 AM對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響Fig.1 The effect of acrylamide on RWA264.7 cell viability注：**表示與空白組相比差異極顯著(P<0.01)

其次，以不同質(zhì)量濃度山藥多糖處理巨噬細(xì)胞24 h，以評(píng)價(jià)山藥多糖的細(xì)胞毒性，并確定合適的作用濃度,結(jié)果如圖2所示。一定質(zhì)量濃度山藥多糖質(zhì)量作用后巨噬細(xì)胞活力與未加山藥多糖的對(duì)照組相比無顯著差異，表明山藥多糖在一定濃度范圍內(nèi)不影響巨噬細(xì)胞的正常生長和活力。因此，選取合適質(zhì)量濃度(25.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/mL)的山藥多糖進(jìn)行保護(hù)巨噬細(xì)胞的研究。圖3顯示，與只加AM(4.0 mmol/L)的對(duì)照組相比，25.0 μg/mL山藥多糖預(yù)處理組，巨噬細(xì)胞活力僅能提高10%左右，而山藥多糖質(zhì)量濃度增加至50.0 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞活力大幅度升高，達(dá)到97.8%；而后隨著山藥多糖質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞活力有小幅度波動(dòng)，但細(xì)胞活力始終維持在90.0%以上。結(jié)果表明，山藥多糖能夠抑制AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷，在質(zhì)量濃度為50.0～500.0 μg/mL范圍內(nèi)均能有效恢復(fù)細(xì)胞活力。

圖2 山藥多糖對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響Fig.2 The effect of Rhizoma dioscoreae polysaccharides on RWA264.7 cell viability

圖3 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活力的影響Fig.3 The effect of Rhizoma dioscoreae polysaccharides on acrylamide-induced cell viability注：*表示與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**表示 與空白組相比差異極顯著(P<0.01)；#表示與AM(4.0 mmol/L) 相比差異顯著(P<0.05)；##表示與AM組(4.0 mmol/L)相比 差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.2 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬活力的影響

巨噬細(xì)胞具有非特異性吞噬功能，其吞噬與清除能力是機(jī)體啟動(dòng)免疫的重要途徑之一[18]。山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬活力的影響如圖4所示，4.0 mmol/L的AM誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞吞噬活力下降至80.0%左右，與正常對(duì)照組相比，有顯著差異；而不同質(zhì)量濃度的山藥多糖干預(yù)組，細(xì)胞吞噬活力較誘導(dǎo)損傷組相比有大幅度提升，100.0、200.0 μg/mL的山藥多糖預(yù)處理組，細(xì)胞吞噬活力提高了30.0%左右。500.0 μg/mL的山藥多糖預(yù)處理組吞噬活力有所下降，但仍顯著高于誘導(dǎo)組。結(jié)果表明，山藥多糖能夠抑制AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷，顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬活力。

圖4 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬活力的影響Fig.4 The effect of Rhizoma dioscoreae polysaccharides on acrylamide-induced cell phagocytic activity

2.3 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

研究證明氧化應(yīng)激是AM誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一[19]，山藥多糖具有良好的抗氧化作用，本研究探究了干預(yù)AM誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后，細(xì)胞氧化水平的變化趨勢(shì),圖5和圖6顯示山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化損傷的影響。與正常對(duì)照組比較，4.0 mmol/L AM處理后，反映細(xì)胞脂質(zhì)氧化程度的MDA水平顯著增加，反映細(xì)胞抗氧化能力的SOD酶活力顯著降低；而不同質(zhì)量濃度的山藥多糖預(yù)處理組，與誘導(dǎo)損傷組相比，MDA含量有不同程度的降低，SOD活性也不同程度的增加，且山藥多糖的干預(yù)效果與多糖質(zhì)量濃度呈依賴性變化。

圖5 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的細(xì)胞MDA水平的影響Fig.5 The effect of Rhizoma dioscoreae polysaccharides on the level of MDA under acrylamide damage

ROS是生命活動(dòng)中的重要信號(hào)分子，但是大量產(chǎn)生的活性氧一旦擾亂機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)，便會(huì)加重細(xì)胞損傷，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[20]。山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響如圖7所示，與正常對(duì)照組相比，AM(4.0 mmol/L)誘導(dǎo)組，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加；山藥多糖單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平無顯著影響；相比AM誘導(dǎo)組，25.0 μg/mL山藥多糖預(yù)處理組ROS水平有所降低，但是500.0 μg/mL山藥多糖預(yù)處理組的ROS產(chǎn)生明顯減少，效果更好。研究表明山藥多糖可以提高細(xì)胞抗氧化能力，抑制AM導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞氧化損傷。

圖6 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的細(xì)胞SOD活力的影響Fig.6 The effect of Rhizoma dioscoreae polysaccharides on the activity of SOD under acrylamide damage

a-山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS熒光圖；b-平均熒光強(qiáng)度量化柱形圖圖7 山藥多糖對(duì)AM誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響Fig.7 The effect of Rhizoma dioscoreae polysaccharides on the production of ROS under acrylamide damage

2.4 山藥多糖對(duì)生物大分子氧化損傷的影響

Cu2+/H2O2反應(yīng)體系可通過類Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，而·OH可攻擊蛋白質(zhì)的肽鏈和氨基酸殘基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氧化損傷。首先以Cu2+/H2O2誘導(dǎo)體系構(gòu)建BSA損傷模型，以山藥多糖進(jìn)行保護(hù)，結(jié)果如圖8所示，與正常對(duì)照組相比，誘導(dǎo)損傷組的蛋白殘留量明顯減少，表明蛋白被氧化降解；與誘導(dǎo)損傷組相比，不同質(zhì)量濃度山藥多糖作用下，蛋白殘留量有不同程度的增加，表明山藥多糖對(duì)蛋白有一定的保護(hù)作用。在2.5～50.0 μg/mL，蛋白殘留量呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)山藥多糖質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL時(shí)，蛋白殘留量明顯增加，而50.0 μg/mL的山藥多糖預(yù)處理后，保護(hù)效果開始變差。山藥多糖質(zhì)量濃度為5.0和25.0 μg/mL時(shí)，對(duì)蛋白氧化具有最佳的抑制效果。

圖8 山藥多糖對(duì)BSA蛋白氧化損傷的影響Fig.8 The effect of Rhizoma dioscoreae polysaccharides on oxidative damage of BSA protein

有機(jī)體內(nèi)廣泛存在著銅、鐵等金屬離子，維生素C可將Fe3+還原為Fe2+，在有H2O2存在時(shí)，可通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，對(duì)機(jī)體造成損害?！H作用于DNA致使脫氧核糖環(huán)斷裂，生成MDA及其類似物。MDA及其類似物在酸性條件下與TBA反應(yīng)生成1種粉紅色化合物，該化合物在532 nm處有最大吸光度，因此，可用MDA-TBA反應(yīng)檢測(cè)DNA的損傷程度。以Phen-CuSO4-維生素C體系誘導(dǎo)DNA損傷，山藥多糖進(jìn)行保護(hù)，結(jié)果如圖9所示。不同質(zhì)量濃度(0.5～50.0 μg/mL)的山藥多糖能夠顯著抑制DNA的氧化損傷，質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的山藥多糖保護(hù)組，DNA的氧化程度降至誘導(dǎo)組(多糖未保護(hù)組)的54.3%。隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，DNA損傷氧化程度呈緩慢降低趨勢(shì)，在多糖質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL時(shí)，DNA氧化程度最低(41.9%)，山藥多糖保護(hù)作用最佳；而后隨山藥多糖質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)DNA損傷的抑制效果變差。當(dāng)山藥多糖質(zhì)量濃度達(dá)到50.0 μg/mL時(shí)，氧化程度高于50%。

圖9 山藥多糖對(duì)DNA氧化損傷的影響Fig.9 The effect of Rhizoma dioscoreae polysaccharides on oxidative damage of DNA

不同質(zhì)量濃度的山藥多糖對(duì)脂類氧化損傷的抑制效果如圖10所示。不同濃度的山藥多糖控制脂質(zhì)過氧化的效果存在不同程度的差異，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨山藥多糖濃度的增加，脂質(zhì)過氧化程度整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，與圖8、圖9的變化趨勢(shì)基本一致。當(dāng)山藥多糖質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL時(shí)，脂質(zhì)過氧化程度降至誘導(dǎo)組的53.9%，氧化程度明顯減輕；多糖質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL時(shí)，脂質(zhì)過氧化僅為誘導(dǎo)組的42.0%；山藥多糖質(zhì)量濃度為50.0 μg/mL的保護(hù)組，其氧化程度又略有升高，為誘導(dǎo)組的51.8%，但與誘導(dǎo)組相比，仍有極顯著差異。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，山藥多糖對(duì)脂質(zhì)過氧化有一定的抑制作用，且質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL時(shí)的抑制作用最佳。

圖10 山藥多糖對(duì)脂質(zhì)過氧化的影響Fig.10 The effect of Rhizoma dioscoreae polysaccharides on lipid peroxidation

3 討論與結(jié)論

研究報(bào)道AM能抑制小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫系統(tǒng)[5]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，是確保機(jī)體產(chǎn)生適當(dāng)免疫，維持免疫平衡的關(guān)鍵組成部分。巨噬細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)、抗感染和抗腫瘤等方面起重要作用。例如，在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答中，大部分胸腺依賴抗原必須經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬處理，才能呈遞給T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞還會(huì)釋放多種細(xì)胞因子，共同參與免疫的調(diào)節(jié)；在非特異性免疫過程中，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞非特異性吞噬病原微生物；活化的巨噬細(xì)胞還能識(shí)別、殺傷并及時(shí)清除體內(nèi)腫瘤或變異細(xì)胞[18]。巨噬細(xì)胞的吞噬作用是先天免疫中最基本的防御機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，AM處理后，巨噬細(xì)胞的吞噬功能顯著下降，但與對(duì)照相比，僅下降了20.0%左右，而細(xì)胞活力結(jié)果顯示，在同樣誘導(dǎo)濃度下，細(xì)胞活力下降達(dá)40.0%，說明AM雖然一定程度上損害了巨噬細(xì)胞的吞噬功能，但是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的毒性效應(yīng)更突出。山藥多糖干預(yù)AM組，不僅恢復(fù)了細(xì)胞的生長活力，吞噬能力也大幅度被提升，但與正常組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的活力雖然有一定程度提高，但基本維持在90.0%左右，而吞噬指數(shù)卻高于對(duì)照組，這些結(jié)果表明，山藥多糖能保護(hù)巨噬細(xì)胞，但改善巨噬細(xì)胞免疫作用的效果更顯著。這與LI等[16]報(bào)道的山藥多糖可通過TLR4-NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能結(jié)果一致，但在AM誘導(dǎo)巨噬損傷過程中，山藥多糖是如何調(diào)控TLR4-NF-κB通路，抑制損傷，仍需進(jìn)一步研究。

研究報(bào)道AM對(duì)多種機(jī)體細(xì)胞有毒性作用，且產(chǎn)生毒性的機(jī)制主要是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，AM也被證實(shí)能刺激多種細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死[19]。研究證明山藥多糖具有良好的抗氧化作用，本研究發(fā)現(xiàn)，山藥多糖干預(yù)AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷的機(jī)制也是控制氧化應(yīng)激。如抑制脂質(zhì)過氧化、提高SOD酶活力，減少ROS生成；同時(shí)，大分子損傷模型研究也證實(shí)，山藥多糖對(duì)活性氧引起的DNA、蛋白損傷等具有很好的保護(hù)作用。然而，其是否能有效干預(yù)AM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等，有待進(jìn)一步研究。

研究中發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，山藥多糖都表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用，但細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最佳作用質(zhì)量濃度是500.0 μg/mL，而大分子模型研究最佳作用質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL，二者最佳作用濃度并不一致，這可能是因?yàn)榧?xì)胞模型和單純的分子模型存在一定的差異。但是分析比較圖8、圖9、圖10結(jié)果，整體來看，隨山藥多糖質(zhì)量濃度的升高，抑制率變化趨勢(shì)呈現(xiàn)出高度統(tǒng)一性和規(guī)律性。山藥多糖對(duì)生物大分子的最佳保護(hù)質(zhì)量濃度均為5.0 μg/mL。

多糖活性優(yōu)越，安全性高，已受到越來越多學(xué)者的青睞。如前期報(bào)道，黑靈芝多糖和黑枸杞多糖也可以有效提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活性，抑制AM誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞氧化損傷，有效改善AM染毒大鼠的肝損傷[22-24]。AM的毒性廣泛，危害大。然而，除有效控制AM的產(chǎn)生外，針對(duì)性的控制其危害，進(jìn)行科學(xué)合理膳食干預(yù)，也非常重要。本研究為控制AM危害，以及合理開發(fā)應(yīng)用多糖資源和山藥資源都提供了科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，山藥多糖可以有效控制AM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞毒性作用，主要是通過提高抗氧化能力，抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激，抑制生物大分子氧化損傷，維持細(xì)胞的正常生長和吞噬活力。研究結(jié)果為山藥多糖控制AM的免疫毒性提供了一定的科學(xué)依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅限于細(xì)胞水平的體外研究，對(duì)山藥多糖干預(yù)AM損傷過程中的具體的信號(hào)通路，多糖的相關(guān)作用受體，以及體內(nèi)的保護(hù)作用及機(jī)制等還需進(jìn)一步深入探究。