祁連圓柏精油的化學成分及抑菌活性

李斌山，喬彩虹，張忠，畢陽，梁偉，朱亞同，李子和

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

隨著有害食品微生物對化學合成抑菌劑抗藥性的不斷增強，使得研發綠色環保的新型替代性抗菌物質成為了食品研究領域的熱點問題之一。精油存在于植物的根、莖、葉、樹皮、花和果實中[1]。精油最初的用途僅在制備香熏，化妝品等方面，但近年許多研究發現精油具有良好的抗菌活性，如丁香精油[2]、牛至精油[3]、百里香精油[4]等。由于精油具有的一些理化特性優勢，使它能夠很好的與熏蒸處理結合，讓處理方式變得更加簡單有效，而且能夠有效的解決合成抑菌劑在使用過程中引發的危害人體健康、污染環境和微生物抗藥性等問題。

柏科類植物資源豐富，組織富含精油，其精油在工業中多被用作調香原料，還可以應用于多個領域[5]。祁連圓柏(SabinaprzewalskiiKom.)為柏科(Cupress aceae)圓柏屬(Sabina)高大常綠針葉喬木，是我國特有的綠化樹種[6]。該樹種生長于海拔2 600～4 300 m的陽坡、半陽坡，生態適應幅度寬，抗逆性強，極耐高寒、干旱和土壤貧瘠，主要分布在青藏高原東北部和黃土高原的西部邊緣地帶[7-8]。許多在比較極端苛刻環境下生長的生物反而能夠為人類提供具有重要應用價值的代謝物質。周寶石[9]從祁連圓柏成熟果實的甲醇提取物中分離得到二萜類化合物，結果表明祁連圓柏果實可以作為二萜類化合物的天然資源寶庫。王文蜀等[10]從祁連圓柏的種子中分離出結構為3α-hinokiol的二萜且該物質對人卵巢癌細胞(HO-8910)具有一定抑制作用。劉喜梅等[6]和劉林芳[7]研究發現海拔高度的變化對祁連圓柏葉揮發油成分及其質量分數有一定規律性的影響。但有關祁連圓柏精油抑菌(細菌和真菌)活性的研究鮮見報道。

本文采用水蒸餾法提取祁連圓柏精油，并用GC-MS分析了祁連圓柏精油的主要化學成分；對該精油對多種食品腐敗真菌和細菌的抑菌活性進行研究評價，旨在為柏科類植物天然抑菌劑的開發提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

祁連圓柏(野生)，采自甘肅省天祝藏族自治縣祁連山區；4種采后果蔬腐敗真菌[互隔交鏈孢(Alternariaalternate) 、擴展青霉(Penicilliumexpansum) 、硫色鐮刀菌(Fusariumsulphureum) 、粉紅單端孢(Trichosporonroseum)]、2種革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)〗和2種革蘭氏陰性菌[糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)]均由甘肅農業大學食品科學與工程學院微生物實驗室提供。

1.2 儀器與設備

CN69M/FW80高效植物樣品粉碎機，北京中西遠大科技有限公司；BS200S型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；7890B GC-MS聯用儀，美國安捷倫科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

將祁連圓柏枝葉去除較粗枝干，然后將枝葉剪為約0.5 cm的短枝，烘干(40 ℃、5 h)備用。

1.3.2 祁連圓柏精油的提取

取干燥后的祁連圓柏枝葉400 g，采用水蒸餾法提取精油。物料比為6∶1(g∶g)，蒸餾4 h，停止加熱，油水分離后油相用無水硫酸鈉脫水干燥，收集精油于棕色瓶內4 ℃保存待用。計算精油提取得率，計算公式(1)如下：

(1)

1.3.3 精油成分分析

采用GC-MS計算機聯機分析得到檢出成分，經計算機檢索譜庫，人工分析質譜圖，結合相關文獻資料對檢出成分進行篩選鑒定，通過峰面積歸一法確定各組分的相對含量。

(1)樣品處理：液體直接進樣，進樣量2.0 μL。

(2)氣相色譜條件：色譜柱DB-17MS (30 m×250 mm，0.25 μm)，柱溫：50～250 ℃程序升溫。初始溫度為50 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升至220 ℃，保持8 min，再以20 ℃/min升至250 ℃，保持2 min。進樣口溫度為250 ℃，氦氣載氣，柱流量為1.0 mL/min，以分流方式進樣，分流比為250 ∶1。

(3)質譜條件：采用EI電離方式，電離能量70 eV，離子源溫度250 ℃，接口溫度230 ℃，分子質量掃描范圍15～500 u。

按照本條件進行正構烷烴混合對照品C8～C20的GC-MS分析，以正構烷烴的保留時間計算祁連圓柏精油中各組分的保留指數(kovats index,KI)。計算公式(2)如下：

(2)

式中：tx，被分析組分流出峰的保留時間，min；tn，碳原子數為n的正構烷烴流出峰的保留時間，min；tn+1，碳原子數為n+1的正構烷烴流出峰的保留時間，min；且tn

1.3.4 精油抑菌活性的評價

1.3.4.1 培養基的制備

PDA培養基:馬鈴薯塊莖200 g，1 000 mL蒸餾水，煮沸30 min，4層紗布過濾，濾液加葡萄糖20 g、瓊脂18～20 g，補充蒸餾水至1 000 mL，裝入三角瓶滅菌備用。

液體培養基:牛肉膏0.9 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 1.5 g、蒸餾水300 mL、pH 7.4～7.6，滅菌備用。

1.3.4.2 菌懸液的制備

真菌：分別將4種真菌在PDA中培養7 d后，在培養皿中加入無菌水約15 mL，用玻璃涂布棒刮取孢子，4層紗布過濾于50 mL的三角瓶中，充分振蕩，用血球計數器計數，調至濃度為1×106～3×106CFU/mL備用。

細菌：將活化后的細菌接種于液體培養基，在搖床37 ℃恒溫培養24 h，備用。

1.3.5 祁連圓柏精油對真菌的抑菌效果

1.3.5.1 祁連圓柏精油對真菌菌落生長的影響

參考HABA等[11]的方法并略做修改。在無菌條件下，將1.3.4.2中制備的菌懸液接種在對應的固體培養基上，培養皿蓋中心放入滅菌后的濾紙片(直徑為6 mm)，濾紙片上滴加6、12、24、48 μL的精油，使其在培養皿內空間濃度分別為0.125、0.25、0.5、1 μL/mL，以無菌水做空白對照，密封倒置，28 ℃培養箱內恒溫孵育7 d，以十字交叉法測定菌落直徑，取其平均值，試驗重復3次。

按照濃度梯度測定最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最低殺菌濃度(minimum fungicidal concentration, MFC)。以48 h內抑制率為100%精油濃度為其MIC；連續培養72 h，若仍沒有菌生長，則為MFC。

1.3.5.2 祁連圓柏精油對真菌孢子萌發的影響

采用紙片擴散法測定孢子萌發率。在無菌條件下，用打孔器制取直徑為9 mm、質量分數為2%的瓊脂培養基，置于滅菌載玻片上，滴加孢子懸浮液20 μL，再用滅菌鑷子夾取無菌濾紙片置于培養皿蓋中央，在濾紙片上分別滴加6、12、24、48 μL的精油，以無菌水作對照，于27 ℃孵育后鏡檢觀察孢子萌發情況，當對照組孢子萌發率達到80%時開始計時。每次鏡檢100個真菌孢子，每次實驗重復3次。孢子萌發抑制率計算如公式(3)所示：

孢子萌發抑制率/%

(3)

1.3.5.3 祁連圓柏精油對真菌生物量的影響

在無菌條件下，將1×106CFU/mL菌懸液接種在鋪有玻璃紙的培養基上，在培養皿蓋中心放入滅菌后的濾紙片，分別在濾紙片上滴加6、12、24、48 μL精油，使其在培養皿內空間濃度分別為0.125、0.25、0.5、1 μL/mL，以無菌水做空白對照，密封倒置，在28 ℃ 培養箱內恒溫孵育7 d后取下玻璃紙，稱重，實驗重復3次。

1.3.6 祁連圓柏精油對細菌的抑菌效果

采用濾紙片法測定不同濃度精油對4種細菌的抑菌圈直徑。用移液槍吸取150 μL(106～107CFU/mL)菌液，均勻涂布于培養基表面。將已滅菌的圓形濾紙片呈四邊形形狀鋪在培養基表面，每個培養皿中放4個濾紙片，再分別移取3、6、9、12 μL的精油滴在濾紙片上，每個培養皿只滴加同一個濃度的精油。將培養皿置于37 ℃的生化恒溫培養箱中培養24 h，十字交叉法測量抑菌圈的直徑，無菌水為對照，試驗平行3次，記錄數據，結果取重復實驗的平均值來評價抑菌效果。

用微量稀釋法測定精油對4種細菌的MIC和最低殺細菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)值[12]。將供試菌菌懸液與精油溶液置于96孔板孔內,使其精油濃度分別為150～0.29 μL/mL，置于37 ℃培養24 h后觀察。順濃度梯度由大到小，第1個透明孔所對應的濃度值為MIC。將濃度為MIC和2 MIC孔繼續培養24 h后觀察，透明孔所對應的濃度值為MBC。無菌水為對照，所有實驗重復3次。

1.4 數據分析

本試驗數據采用Microsoft Excel 2013計算平均值和標準誤差(±SE)；采用SPSS Statistics 25.0 軟件進行Duncan′s顯著性分析(P<0.05)；使用Origin 2017軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 精油提取得率

用水蒸餾法對祁連圓柏進行精油提取，得到的精油為淡黃色的油狀液體，精油得率為2.83%。

2.2 精油的化學成分

從祁連圓柏精油中總共鑒別出47種化學成分(表1)，其中從已鑒定出的揮發精油化學成分類型看，主要成分為單萜烯類、倍半萜烯及其含氧衍生物，其他為少量的酯。其中相對含量較多的組分為檜烯(19.59%)、α-杜松醇(11.81%)、(-)-4-萜品醇(10.90%)、γ-松油烯(5.55%)、香茅醇(5.06%)、月桂烯(3.70%)和D-檸檬烯(3.34%)，占總成分的63.535%。此外，還有少量的酯類化合物，祁連圓柏精油可能是通過多種化學成分協同發揮作用從而產生抗菌效果。

表1 祁連圓柏精油揮發性成分Table 1 Volatile components of Sabina przewalskii Kom.essential oil

續表1

2.3 精油對真菌的抑菌活性

2.3.1 精油對菌落生長的影響

隨著祁連圓柏精油處理濃度的增加，對真菌菌落生長的抑制率逐漸增大(P<0.05)，說明祁連圓柏精油對4種真菌具有良好的抑制效果，且抑制效果與精油濃度密切相關(圖1)。在同一濃度處理下，精油對不同菌種的菌落生長抑制率也不同，說明不同菌種對精油的耐受性不同。從4個濃度的抑菌效果可以看出(圖2)，青霉對精油的敏感性更強，根據精油對4種真菌菌落生長的抑制作用由強到弱可以排序為：擴展青霉﹥硫色鐮刀菌﹥粉紅單端孢﹥互隔交鏈孢。

圖1 精油處理對真菌菌落生長的影響Fig.1 Effect of essential oil treatment on fungal colony expansion

圖2 精油處理對真菌菌落生長的抑制作用Fig.2 Essential oil treatment inhibited the colony growth of fungi注：大小寫字母分別代表組間和組內差異顯著性(P<0.05)(下同)

2.3.2 精油對孢子萌發的影響

祁連圓柏精油處理有效抑制了4種真菌孢子的萌發，其抑制作用隨著祁連圓柏精油濃度的增加而逐漸增強(圖3)。同一濃度下，精油對4種菌孢子萌發的抑制作用差異性不大，不同濃度的處理下，精油對青霉孢子萌發的抑制效果最佳。當精油處理濃度達到1 μL/mL時，對4種真菌的孢子萌發抑制率皆在60%以上。

圖3 精油處理對真菌孢子萌發的抑制作用Fig.3 Essential oil treatment inhibited fungal spore germination

2.3.3 精油對菌絲生物量積累的影響

祁連圓柏精油處理能夠顯著降低4種真菌的生物量(P<0.05)(圖4)，其抑制效果有著顯著的濃度依賴性，即隨著祁連圓柏精油處理濃度的增加，真菌的生物量顯著降低。當精油處理濃度為1 μL/mL時，4種真菌中擴展青霉的生物量最小。

a-互隔交鏈孢；b-擴展青霉；c-硫色鐮刀菌；d-粉紅單端孢圖4 精油處理對真菌生物量的降低作用Fig.4 Essential oil treatment reduced the biomass of fungi

2.4 精油對細菌的抑制活性

祁連圓柏精油對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)以及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、糞產堿桿菌)均有明顯的抑制作用(圖5)。而且，同一精油濃度對不同菌種的抑制效果不同。在精油等梯度濃度增加時，4種菌抑菌圈直徑變化的幅度也有差異，對糞產堿桿菌的抑制效果較好，抑菌圈直徑可達21.29 mm；而對金黃色葡萄球菌的抑制效果較差，抑菌圈直徑為18.67 mm(表2)。

2.5 MIC值和MBC/MFC值

擴展青霉和硫色鐮刀菌的MIC和MFC值分別為0.875、1 μL/mL，比互隔交鏈孢和粉紅單端孢的MIC和MFC值低，說明擴展青霉和硫色鐮刀菌對精油的敏感性要強于互隔交鏈孢和粉紅單端孢。通過對4種細菌的MIC和MBC值的比較可以發現(表3)，2種革蘭氏陰性菌有較高的MIC和MBC值，這表明祁連圓柏精油對革蘭氏陽性菌的抑菌效果強于革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC值都為2.34 μL/mL；革蘭氏陰性菌大腸桿菌和糞產堿桿菌的MIC值為4.68 μL/mL，是革蘭氏陽性菌的2倍。大腸桿菌的MBC值為9.36 μL/mL，在4種供試菌中最高，表明祁連圓柏精油對大腸桿菌的抑制效果較差。

表2 祁連圓柏精油對4種細菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of essential oil of Sabina przewalskii Kom. on four bacteria species

圖5 精油處理對細菌生長的影響Fig.5 Effect of essential oil treatment on bacterial growth

表3 MIC值和MBC/MFC值 單位：μL/mL

3 討論

精油是植物源天然產物中具有較強殺菌或抑菌活性的物質，對于細菌、真菌等微生物都具有顯著的抑制作用，有替代傳統化學合成殺菌劑的潛力[13]，但某些植物由于其獨特的功效或特殊的生長條件，使其自身價格昂貴。而柏科類植物資源豐富，生態適應幅度寬，一般用作綠化植物，更適合作為精油提取的廉價材料。劉林芳[7]和劉喜梅等[14]發現不同海拔高度的祁連圓柏精油成分和含量存在差異性。本實驗以天祝縣祁連圓柏為材料提取的精油得率為2.83%，且成分中共鑒別出47種化合物。在前人研究中發現，5種揮發精油化學組成存在差異，相同成分有7種，分別為α-蒎烯、γ-松油烯、(R)-(-)-4-萜品醇、大根香葉烯、(+)-δ-杜松烯、欖香醇和柏木腦,且這5種精油中α-蒎烯含量都在20%以上。而本實驗所提取的精油成分中不含有α-蒎烯、(+)-δ-杜松烯、欖香醇和柏木腦，其他相同成分的含量也有很大差異。這說明不同地區及不同海拔高度的變化對祁連圓柏揮葉油成分及其質量分數有一定的影響，這可能是因為揮發油的主要成分是單萜及其含氧衍生物和部分倍半萜類化合物，而萜類物質的種類、質量分數會受到海拔高度、大氣溫度、薄霧天氣相對數量、太陽輻射等環境因素的影響，所以會使精油成分種類和質量分數發生變化。

RYU等[15]研究發現刺柏針葉中木脂素類化合物具有一定抗炎、抗病毒等生物活性。蔣繼宏等[16]對6樹種的植物揮發油的抑菌活性進行了研究，結果表明龍柏揮發油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制效果。DERWICH 等[17]對7種細菌進行了體外抗菌活性實驗，結果發現刺柏精油對供試細菌菌株表現出有效的殺菌活性，MIC為 0.02～0.40 mg/mL。本研究也發現，祁連圓柏精油對4種細菌均有一定的抑制作用，這與劉林芳[7]的研究結果一致，而且祁連圓柏精油對4種真菌(P.expansum、F.sulphureum、A.alternata及T.roseum)也具有抑制活性。植物精油具有較強抑菌活性的原因是成分中有酚類、萜烯類、醛酮類等物質[18]。GARRE等[19]通過研究發現D-檸檬烯與熱處理結合能夠有效提高D-檸檬烯的抑菌活性。胡小剛等[20]研究發現R-和S-芳樟醇均具有良好的抗菌活性。本研究結果表明，祁連圓柏精油成分中含有大量的萜烯類物質，其對4種真菌和4種細菌均有明顯的抑制作用，而D-檸檬烯、芳樟醇、丁香酚、香茅醇等物質都在祁連圓柏精油中被檢測出來，結合丁華等[21]、郭峰等[22]發現丁香酚、香茅醇等物質也具有抗菌功效，這能夠證實祁連圓柏具有抑菌活性的基礎，也可以作為精油單體提取優先選擇的材料。雖然這幾種物質含量占比不太高，但是微量成分在抗菌活性中也會有至關重要的作用，這可能是成分之間相互作用產生的協同作用[23]。綜合以上研究發現，柏科植物的抑菌效果具有普遍性，這為發現和開發柏科植物資源的利用價值提供新的思路。

4 結論

本研究所提取的祁連圓柏精油得率可達2.83%，經GC-MS分析測定的主要成分為檜烯、α-杜松醇、(-)-4-萜品醇、γ-松油烯、香茅醇、萜品油烯、月桂烯、D-檸檬烯等物質，占總成分的63.535%。該精油對4種果蔬腐敗真菌孢子萌發和菌落生長均有較好的抑制活性，且抑制活性存在顯著濃度依賴性。對革蘭氏陽性菌的抑菌活性強于革蘭氏陰性菌。以上結果對祁連圓柏精油的開發利用提供依據，以期為開發天然綠色抑菌劑提供新材料。