基于高通量測序分析果桑茶對2型糖尿病模型小鼠腸道菌群的影響

魏建敏，楊華連，陳莉*，盧紅梅，石慶疊，張祥瑞，涂青

1(貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)2(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)

糖尿病是一種由胰島素分泌不足、糖脂代謝失衡而導致的以高血糖為特征，且具有遺傳傾向的內分泌代謝性疾病[1-2]，其中以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)居多，占糖尿病病例的90%以上[3-4]，該病還會引發多種并發癥，如心血管疾病、糖尿病、腎病、冠心病等[5]。目前，對T2DM的治療通常采用口服或注射胰島素等藥物治療的方式，但其存在嚴重的副作用[6-7]。因此，從天然植物中尋找具有顯著療效和低副作用的活性成分已成為當前糖尿病治療領域的研究熱點。

果桑是桑科桑屬以結果為主、果葉兼用的落葉木本植物桑樹的統稱[8]，是一種“藥食同源”植物。其葉、枝、果、根中均含有多種營養成分及黃酮、多糖、生物堿類等已被證實具有降糖功效的生物活性物質[9-11]。研究表明，果桑中存在天然的α-葡萄糖苷酶、α，β淀粉酶抑制劑1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)和蕎麥堿，桑葉DNJ可通過激活db/db小鼠骨骼肌中的胰島素信號PI3K/AKT途徑來提高胰島素敏感性，從而達到降血糖的效果[12]。

腸道菌群是人體最大的微生態系統，人體腸道內居住著超過1014個的微生物[13]，它們在調節機體能量攝取、腸道通透性、維持腸道免疫屏障等方面發揮著重要作用[14]。近年來，很多研究表明T2DM與腸道菌群失調有關[15-17]。LARSEN等[18]研究T2DM和非T2DM人體腸道菌群組成的差異發現，與非糖尿病人相比，糖尿病人的厚壁菌門(Firmicutes)和梭狀體類的比例明顯降低；SEDIGHI等[19]研究發現，在T2DM患者中，乳酸菌水平明顯較高，而雙歧桿菌在健康人中明顯較多。何雪冬等[20]通過Meta分析發現，與健康人群相比，糖尿病患者乳桿菌、擬桿菌、梭菌數量有不同程度的增加，雙歧桿菌數量下降。基于之前的研究成果，本研究以桑葉、桑枝皮、桑根皮為原料，按62∶19∶19的質量比制成袋泡茶，以鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)誘導聯合高脂飲食飼養建立2型糖尿病模型小鼠為對象，通過高通量測序方法，從小鼠腸道菌群方面探究果桑茶對T2DM模型小鼠腸道菌群的調整作用，為果桑降糖保健產品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

體重(20±2) g清潔級5周齡雄性C57BL/6J小鼠購于貴州醫科大學實驗動物中心，使用許可證號SCXX(京)2014-0004；桑葉、桑枝皮、桑根皮采自貴州開陽某桑葚基地，按62∶19∶19的質量比制成袋泡茶；STZ(純度≥98%)，Sigma公司；羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)(純度≥98%)，阿拉丁化學試劑有限公司；0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)(分析純)，索萊寶生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004N分析電子天平，上海菁海儀器有限公司；FW-80萬能粉碎機，上海仕元科學器材有限公司；VaCo 5-Ⅱ-D真空冷凍干燥機，Zirbus technology GmbH Hilfe Gottes；SW-CJ-1FD無菌操作臺，上海蘇凈實業有限公司；魚躍580型血糖儀，江蘇魚躍醫療設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑制備

果桑復配袋泡茶浸提液凍干粉：將袋泡茶在水溫75 ℃，茶水比1∶100(g∶mL)，沖泡時間50 min的條件下沖泡1次，取其浸提液置于真空冷凍干燥機中凍干備用。

10%果桑復配茶高脂飼料：將果桑復配茶添加10%(質量分數)到高脂飲食飼料中，并壓制成復合飼料備用。

STZ溶液：現用現配，臨用時使用0.1 mol/L、pH 4.5檸檬酸緩沖液配制，按照給藥劑量35 mg/kg配制成質量濃度為3.5 mg/mL的STZ溶液。

0.5%(質量分數)CMC-Na：稱取CMC-Na 0.5 g，加入雙蒸餾水至100 mL，并加熱溶解至澄清溶液，置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 動物分組及處理

小鼠進入實驗室穩定喂養7 d后禁食不禁水過夜12 h，次日通過剪尾取血法測定小鼠空腹血糖和體重，剔除極值后隨機選取10只小鼠作為正常對照組給予普通飼料喂養，其余小鼠采用高脂飲食飼養16周致小鼠呈肥胖狀態，按小鼠體重注射35 mg/kg STZ溶液，給藥量為0.1 mL/10g，7 d后血糖水平高于11.1 mmoL/L即為建模成功。

將血糖水平高于11.1 mmoL/L的小鼠穩定性飼養4周后，按照空腹血糖水平隨機分組為4組，每組10只，分別為正常對照組(Control)、模型對照組(Model)、陽性對照組(Metformin)及果桑茶試藥組GD-2組、GD-3組，共5組。GD-2受試組采用小鼠自由攝食的方式，正常對照組、模型對照組及GD-3受試組采取灌胃方式進行給藥，給藥劑量依據《藥理實驗方法學》中“標準體重動物劑量換算表”來確定，水提物灌胃劑量為200 mg/kg，具體分組及給藥情況見表1。灌胃開始后，根據小鼠體重變化調整小鼠灌胃劑量，持續28 d。

表1 試驗小鼠分組及給藥情況Table 1 Grouping and administration of experimental mice

1.3.3 樣品采集

連續給藥28 d后禁食12 h，每組隨機選3只小鼠收集糞便并于液氮中貯存。

1.3.4 DNA提取及測序

樣本DNA提取并進行高可變區PCR擴增后，使用Nova Seq PE250 測序平臺對各組小鼠腸道內容物16S rDNA V3+V4區進行測序。細菌16S rDNA V3+V4區的通用引物名稱為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′,)、805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。測序數據使用最新的性能更優的QIIME 2分析流程，調用DADA2[21]對數據進行去噪，相當于以100%的相似度聚類，去冗余后得到特征(Feature)，然后基于Feature數據進行菌群結構組成及菌群多樣性分析。

1.4 數據分析

將高通量測序得到的原始數據進行優化，得到有效數據，基于有效數據按97%相似性進行操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)聚類分析，對OTU序列進行物種注釋。基于OTU結果，通過α多樣性分析小鼠腸道菌群多樣性、β多樣性分析小鼠腸道菌群間的組成差異，根據繪制的樣品各分類水平下的群落結構圖、熱圖分析菌群結構組成，根據線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)值分布柱狀圖和進化分支圖進行LEfSe(LDA effect size)多級物種差異判別分析，采用SPSS 19.0進行顯著性差異分析，P<0.05認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 果桑茶對T2DM模型小鼠空腹血糖值影響

如表2所示，當連續給藥后，與模型組相比，其他各組小鼠的空腹血糖值明顯降低，差異極顯著(P<0.01)，陽性組的降糖幅度為43.60%，GDm組的降糖幅度為40.05%，其降糖作用與陽性組相比無明顯差異；GDh組其降幅為25.83%。以上結果說明，果桑茶具有和二甲雙胍藥物一樣的降血糖功效，其中GDm組降糖效果最明顯。

表2 果桑茶對T2DM模型小鼠空腹血糖值影響Table 2 Effect of fruit mulberry tea on fasting blood glucose in T2DM model mice

2.2 菌群多樣性分析

2.2.1 α多樣性分析

本研究采用Chao1、Shannon及Simpson指數來評估小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性，Good′s Coverage反映樣本的測序深度。由表3可知，5個組的Good′s Coverage值均為1，說明測序深度已飽和，實驗數據合理可用。Chao1指數反映菌群的總數，Chao1值越大，菌群數越多，所測定樣品中，果桑茶給藥組(GDh組、GDm組)菌群的多樣性均高于模型對照組和陽性對照組，但低于正常對照組。Shannon和Simpson指數反映菌群的多樣性，Shannon值越大，菌群多樣性越高，5組樣品中正常對照組的Shannon值最大，模型對照組最小，其余3個組差別不大，均小于正常對照組，大于模型對照組；Simpson值越大，菌群多樣性越低，GDh組的Simpson值最小，陽性對照組次之，其余3個組的值為0.96～0.98。以上結果表明，長期持續的高脂高糖飲食會很大程度地降低小鼠腸道菌群的多樣性，而果桑茶產品對調節小鼠腸道菌群多樣性有顯著效果，這可能是果桑茶中的降糖成分發揮了積極作用。

表3 α多樣性比較結果Table 3 α diversity comparison results

2.2.2 β多樣性分析

β多樣性分析可反映不同樣本菌群間是否存在差異性。本試驗采用主成分分析(principal component analysis，PCA)分析樣本間的多樣性。

如圖1所示，橫坐標為PCA1，貢獻率為40.44%，縱坐標為PCA2，貢獻率為14.04%，可以代表大部分變量信息，是樣品菌群結構組成差異的主要因子。分析可知，果桑茶給藥組、模型對照組和陽性對照組腸道菌群組成結構較正常對照組發生了偏移，模型對照組和陽性對照組均與GDh組在物種組成上有一定程度的相似，而GDm組與正常對照組最接近，說明GDm組在調節小鼠腸道菌群方面效果較為顯著。

圖1 樣本細菌主成分分析Fig.1 Principal component analysis of bacteria in samples

2.3 菌群構成分析

2.3.1 菌群組成分析

各組小鼠腸道中相對豐度較高的菌群比較如表4所示。由圖2、圖3可知，在門水平上5個樣品腸道菌群以厚壁菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)等為主。其中，擬桿菌門是正常對照組的絕對優勢菌門，其相對豐度為47.89%，與其他組差異顯著(P<0.05)，模型對照組中擬桿菌門的相對豐度為15.86%，比正常對照組少32.03%，GDm組擬桿菌門的相對豐度為21.06%；厚壁菌門為正常對照組的次要優勢菌門，相對豐度為39.10%，在模型對照組中其相對豐度達到了54.49%，成為絕對優勢菌門，經果桑茶給藥喂養后，給藥組厚壁菌門數量有不同幅度降低，逐漸接近正常對照組水平，其中GDm組效果最明顯，與正常對照組相比差異不顯著(P<0.05)；變形菌門在正常對照組中的相對豐度為4.72%，而在模型對照組中增加至20.35%，經藥物治療后，該菌群漲幅不大，與模型對照組無顯著差異(P<0.05)，說明果桑茶對此菌群的調節作用不明顯。

屬水平上的物種相對豐度如圖4所示。Muribaculaceae_unclassified是一種有益菌屬[22]，由圖4、圖5可知，其是正常對照組的優勢菌屬，相對豐度為28.89%，在模型對照組、陽性對照組、GDm組、GDh組的相對豐度分別為2.79%、0.20%、6.63%和4.25%，說明果桑茶能在一定程度上抑制有益菌屬Muribaculaceae_unclassified的下降。嗜膽菌屬(Bilophila)為模型對照組的優勢菌屬，其相對豐度為11.23%，而在正常對照組中僅占0.06%，陽性對照組、果桑茶給藥組均有效地抑制了這種現象，其中以陽性對照組的效果最為顯著，嗜膽菌屬的相對豐度為1.56%，其次是GDh組，嗜膽菌屬的相對豐度為7.86%。陽性對照組、GDm組和GDh組的優勢菌屬分別為Lachnospiraceae_unclassified、艾克曼菌屬(Akkermansia)和毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)。

以上結果表明T2DM模型組小鼠與正常組小鼠腸道微生物群落結構存在明顯差異，果桑茶可增加糖尿病小鼠中有益菌群的相對豐度，具有調節糖尿病小鼠腸道菌群失調的效果[23]。

表4 各組小鼠豐度較高的微生物比較Table 4 Microbe comparison of mice with higher abundance in each group

圖2 門水平上的物種相對豐度Fig.2 Relative abundance of species at the phylum level

圖3 門水平上有顯著性差異的主要物種Fig.3 The main species with significant difference at the phylum level注：圖中不同字母表示不同樣品間物種差異顯著(P<0.05)(下同)

圖4 屬水平上的物種相對豐度Fig.4 Relative abundance of species at the genus level

圖5 屬水平上有顯著性差異的主要物種Fig.5 The main species with significant difference at the genus level

2.3.2 菌群結構差異性分析

將屬水平豐度排名在前30的菌群，以不同組間豐度相似性聚類的方式繪制熱圖，根據顏色的深淺定義數值的大小，通過顏色的不同來反映各組小鼠腸道菌群結構組成的相似性及差異性。由圖6分析可知，GDh組和模型對照組歸為一類，GDh組中毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)相對豐度極高，相關研究表明人體腸道共生菌群中的毛螺菌科成員可表達2種“超級抗原”，這類超級抗原可激活體內的免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)應答，在腸道穩態中發揮重要作用[24]，說明果桑茶能促進高脂飲食小鼠體內有益菌群的增長。GDm組和正常對照組歸為一類，表明GDm組小鼠腸道菌群聚類分析結果與正常小鼠最為接近，GDm組調節小鼠腸道菌群的效果最好。

由以上分析可知，不同組小鼠的腸道菌群具有相似性的同時也存在一定差異性，高脂飲食造模致糖尿病的過程中小鼠腸道菌群逐漸偏離正常，而果桑茶對小鼠腸道菌群的調節具有積極作用。

圖6 屬水平上的相對豐度聚類熱圖Fig.6 Cluster heatmap of relative abundance at the genus level

2.4 LEfSe多級物種差異判別分析

LEfSe是一種用于發現和解釋高維度數據生物標識的分析工具，能夠在組與組之間尋找具有統計學差異的生物標志物 (biomarker)。圖7是從門到種水平下各組樣本的LDA值分布柱狀圖，物種的LDA得分用橫坐標來表示，LDA值>3的物種為具有統計學差異的biomarker。圖8是各組樣本的進化分支圖。

結合圖7、圖8分析可知，正常對照組中對群落結構影響較大的物種有擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌門、擬桿菌目(Bacteroidales)、Muribaculaceae、Muribaculaceae-unclassfied、Muribaculum等。陽性對照組中對群落結構影響較大的物種有厚壁菌門、梭桿菌目(Clostridiales)、梭桿菌綱(Clostridia)、Bacteria、Ruminiciostridium-9-unclassfied、Ruminiciostridium-9等。模型對照組中對群落結構影響較大的有嗜膽菌屬、unclassfied-Bilophila、理研菌科(Rikenellaceae)、另枝菌

屬、Paramuribaculum、Paramuribaculum-intestinale、Alistipes-unclassfied，Alistipes是小鼠中細菌最豐富的屬之一，它與調節胰島素釋放和逆轉胰島素抵抗的腸道激素的釋放有關[25]。GDm組中對群落結構影響較大的物種有擬桿菌屬(Bacteroides)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、unclassfied-Bacteroides-sp、Desulfovibrionaceae-unclassfied、副擬桿菌屬(Parabcteroides)、Tannerellaceae、Parabcteroides-unclassfied。GDh組中對群落結構影響較大的物種有毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌屬UCG014(Ruminococcaceae-UGG-014)、Ruminococcaceae-UGG-014-unclassfied、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、Romboutsia。

圖8 各組樣本的進化分支圖Fig.8 Evolutionary branch diagram of each group of samples注：小圓圈:圖中由內至外輻射的圓圈代表了由門至屬的分類級別。 不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈 直徑大小與相對豐度大小呈正比；顏色：無顯著差異的物種統一著色 為黃色，差異顯著的物種Biomarker跟隨組別進行著色，紅色節點表示 在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，綠色節點表示在綠色組別中 起到重要作用的微生物類群；未能在圖中顯示的Biomarker對應的物種 名會展示在右側，字母編號與圖中對應

3 討論

腸道菌群的狀態可以通過糞便菌群的變化反映出來，高通量測序技術現已廣泛應用于腸道菌群研究等多個領域，與傳統檢測方法相比，具有更準確定量、實時檢測的優勢。本研究通過高通量測序技術對小鼠糞便進行檢測，分析探討果桑茶對2型糖尿病模型小鼠腸道菌群的調節效果。

菌群α多樣性分析表明，模型對照組小鼠腸道菌群的多樣性與正常對照組相差較大，正常對照組與給藥組的Chao1和Shannon值均大于模型對照組，模型對照組的Simpson值大于GDm組和正常組而小于GDh組和陽性對照組，說明糖尿病的產生會降低小鼠腸道菌群的多樣性，而果桑茶可以提高腸道菌群的豐度，其中GDm組效果最好。β多樣性分析發現正常對照組與GDm組、GDh組與陽性對照組群落構成差異較小，GDm組小鼠的腸道菌群構成最接近正常對照組。

菌群構成分析發現，在門和屬水平上，各組小鼠腸道菌群存在明顯差異。在門分類水平上，擬桿菌門和厚壁菌門是正常對照組小鼠腸道菌群中的優勢菌門，這與BEZIRTZOGLOU等[26]，QIN等[27]的研究結果相似，厚壁菌門和擬桿菌門能共同促進對糖的分解利用[28]，相關研究表明厚壁菌門與擬桿菌門比值與個體體重呈正相關，經高脂飲食后，模型對照組中厚壁菌門相對豐度升高而擬桿菌門相對豐度降低，給藥治療后，擬桿菌門相對豐度有所增加，GDm組效果最顯著。在屬分類水平上，Muribaculaceae_unclassified是正常組中的優勢菌屬，其在模型對照組和陽性對照組中的豐度最低，與之相比在果桑茶給藥組中其豐度有明顯提高。嗜膽菌屬是一種2型糖尿病的標志物，其中的沃氏嗜膽菌Bilophilawadsworthia能引起和加重炎癥[29]，與正常對照組相比，模型對照組中嗜膽菌屬呈明顯上升趨勢，而給藥組有效地抑制了這種現象。GDm組中的優勢菌屬艾克曼菌屬可降解黏蛋白生成短鏈脂肪酸，與肥胖、糖尿病等疾病呈負相關[30]。GDh組優勢菌屬毛螺菌科NK4A136群對腸道黏膜損傷具有一定的修復作用，在調節和穩定腸道菌群方面發揮著重要作用[31]。說明果桑茶能在調節2型小鼠糖尿病腸道菌群方面發揮積極作用。

LEfSe多級物種差異判別分析表明，與模型對照組相比，GDm組中的嗜膽菌屬等有害菌群的豐度降低，而有益菌群擬桿菌屬等的豐度增高；此外，GDm組小鼠的腸道菌群多樣性和物種豐富度較模型對照組顯著提高，與正常對照組小鼠接近，這些結果表明果桑茶在將糖尿病小鼠腸道菌群紊亂調節到接近正常狀態方面具有一定的功效，這可能與果桑茶中的多糖、黃酮等生物活性物質有關[32]。

4 結論

本研究采用高通量測序對果桑茶對2型糖尿病模型小鼠腸道菌群的影響進行研究。結果不僅驗證了2型糖尿病會破壞小鼠腸道菌群平衡，降低菌群豐度，同時證明了果桑茶能提高小鼠腸道菌群的豐度，并在一定程度上增加有益菌群的數量，降低高血糖特征菌群及有害菌群的影響，促進腸道菌群良性發展。本研究的結果可為果桑資源的綜合應用奠定理論基礎，同時為果桑茶應用于2型糖尿病的干預治療提供一定的科學依據。