羅非魚鱗膠原肽螯合鋅抗氧化及抑菌活性研究

郭洪輝，陳暉，趙雪，方華，洪專

(自然資源部第三海洋研究所 海洋生物資源開發利用工程技術創新中心，福建 廈門，361005)

羅非魚別稱非洲鯽魚，肉質鮮嫩，富含多種營養物質，是中國魚類養殖中的重要品種[1]。目前，羅非魚的加工主要以凍全魚與凍魚片為主，在加工過程中會產生大量的魚鱗副產物，由于這些副產物市場價值不高，往往存在直接丟棄、加工利用率低等問題[2]。有研究表明，魚鱗中豐富的膠原蛋白具有抗氧化、降血壓、調節免疫等生物活性，利用酸、堿、酶解等方法可將魚鱗膠原蛋白進一步降解成小分子的膠原肽，與膠原蛋白相比，膠原肽在消化吸收、功能特性等方面都有明顯提高[3]。

近年來，微量元素與膠原肽形成螯合物的研究備受關注。鋅是人和動物所需重要的微量元素之一，具有重要生物功能。鋅在細胞生長和分化、蛋白質和DNA合成、脂質代謝和免疫功能等方面都發揮重要作用[4]。當膠原肽與鋅離子結合時，可以作為鋅補充劑，在消化過程中避免與植酸、膳食纖維在胃腸道內形成不溶性復合物，其鋅吸收利用率往往高于鋅鹽及蛋白-鋅螯合物[5]，還能有效增強其生物活性，如抗氧化[6]、抑菌[7]等功效，添加到飼料、食品、化妝品中，具有很大的研發價值[8]。

在前期實驗中，實驗室以羅非魚鱗為原料，制備了羅非魚鱗膠原肽螯合鋅，并進行了分離純化[9-10]。本文擬對羅非魚鱗膠原肽螯合鋅的組成結構及抗氧化、抑菌功效進行進一步的分析研究，為羅非魚魚鱗的精深加工及高值化利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚鱗膠原肽(collagen peptide，CP)和羅非魚鱗膠原肽螯合鋅(CP-Zn)，實驗室自制[9-10]；DPPH生化試劑(BR)、標準氨基酸，Sigma-Aldrich上海貿易有限公司；LB瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，索萊寶生物科技有限公司；大腸埃希氏桿菌[Escherichiacoli，CMCC(B) 44103]、枯草芽孢桿菌[Bacillussubtilis，CMCC(B) 63501]、白色假絲酵母[Candidaalbicans，AS2.2086]、金黃色葡萄球菌[Staphylococcusaureus，CMCC(B) 26003]，廈門大學生命科學學院；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UDK13自動凱氏定氮儀，意大利VELP公司；Mili-Q超純水純化系統，美國millipore公司；AA-6680原子吸收光譜，日本島津公司；生物超凈工作臺，蘇凈安泰公司；ZQTY-90S全溫恒溫培養箱，上海知楚儀器有限公司；立式壓力蒸氣滅菌器，STIK施都凱儀器設備有限公司；Bruker microflex基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀，德國布魯克道爾頓公司；戴安ICS3000離子色譜儀、AminoPac PA10氨基酸分析柱(2 mm×250 mm)、AminoPac PA10保護柱(2 mm×50 mm)，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 成分測定

水分含量的測定：直接干燥法(GB/T 5009.3—2010)；灰分含量的測定：馬弗爐灰化法(GB/T 5009.4—2010)；粗蛋白含量的測定：微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2016)；鋅濃度的測定：采用原子吸收光譜法(GB/T 5009.14—2017)。

1.3.2 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)檢測

20 mg 2, 5-二羥基苯甲酸(2, 5-dihydroxybenzoic acid，DHB)溶解于1 mL 的乙腈水溶液(乙腈的體積分數為50%)中作為基質溶液。將10 g/L 的樣品水溶液與等體積的基質溶液混勻后，取1 μL點樣于不銹鋼靶上，自然干燥后，推入離子源中測定。質譜條件：337 nm N2激光光源，激光脈沖3 ns, 加速電壓19.0 kV，反射電壓15.4 kV。譜圖采集模式為正離子反射模式，每張譜圖累計600次[11]。

1.3.3 氨基酸組成檢測

稱取0.1 g樣品于水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl，置于110 ℃的恒溫干燥箱內，待消化完全后，稀釋200倍，用0.44 μm的濾膜過濾，收集濾出液，待上樣。采用AminoPac PA10氨基酸分析柱，以1 mol/L CH3COONa、250 mmol/L NaOH的水溶液為流動相，進樣量10 μL測定樣品的氨基酸組成和含量[12]。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測定

將檢測樣品與等體積的0.1 mol/L DPPH-無水乙醇溶液混合均勻，室溫避光反應30 min，于517 nm處測吸光值；樣品與無水乙醇溶液混合反應為對照組；超純水與DPPH-無水乙醇溶液混合反應為空白組[13]。每組試驗重復3次，取平均值并求標準差。DPPH清除率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0、A1、A2分別為空白組、對照組、樣品組的吸光度。

1.3.5 羥自由基清除率的測定

在0.4 mL樣品中依次加入0.4 mL 9 mmol/L的FeSO4、0.4 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和0.4 mL 8.8 mmol/L H2O2，37 ℃下水浴30 min，于510 nm處測吸光度。以超純水代替H2O2作為對照組；以超純水代替樣品作為空白組[14]。羥自由基清除率的計算如公式(2)所示:

(2)

式中：A0、A1、A2分別為空白組、對照組、樣品組的吸光度。

1.3.6 Fe3+還原能力的測定

取0.5 mL樣品溶液，加入0.5 mL 10 g/L K3[Fe(CN)6]溶液，混勻，于50 ℃水浴保溫20 min，再加入0.5 mL的100 g/L三氯乙酸溶液，混勻后8 000 r/min離心10 min后取上清液1 mL，加入1 mL超純水和150 μL 1 g/L的FeCl3溶液，混勻，靜置10 min后，于700 nm處測定吸光度[15]。

1.3.7 抑菌活性檢測

用接種環分別挑取大腸埃希氏桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的適量菌體，于LB固體培養基上劃線，37 ℃恒溫培養24 h；挑取白色假絲酵母的適量菌體，于馬鈴薯葡萄糖固體培養基上劃線，28 ℃恒溫培養24 h。將活化好的菌體用無菌生理鹽水稀釋重懸至105CFU/mL，均勻涂布于瓊脂培養基上。

用無菌移液槍各吸取10 μL 300 g/L的CP及CP-Zn溶液，緩慢滴加在直徑約6 mm的滅菌濾紙片上，待其擴散均勻，再將濾紙片平鋪于含菌平板上，在培養箱中恒溫培養24 h，培養結束后觀察是否具有抑菌效果，測定抑菌圈直徑[16]。

1.3.8 統計方法

2 結果與分析

2.1 成分分析

CP和CP-Zn的主要組成成分如表1所示，與GB 31645—2018《食品安全國家標準 膠原蛋白肽》中的理化指標相比，CP的蛋白質量分數≥90.0%，灰分質量分數≤7.0%，水分質量分數≤7.0%，均符合膠原蛋白肽的國家標準。在與鋅發生螯合后，蛋白質量分數有所下降，鋅的質量分數較高，達到(13.31±1.49)%，說明制備的CP有較好的鋅螯合能力。

表1 CP和CP-Zn的主要組成成分 單位：%

2.2 MALDI-TOF質譜圖

圖1是CP和CP-Zn的MALDI-TOF質譜圖。由圖1-a可知CP的m/z出峰位置均在1 200以內，主要為膠原寡肽。如圖1-b所示，CP-Zn的主要特征峰為質荷比887.980的離子，指認為[M-H+Zn]+，與圖1-a相比可以得出，主要是823.667的準分子離子峰[M+H]+結合了1個鋅得到的，這同時也表明了CP-Zn的生成[17]。

a-CP；b-CP-Zn圖1 CP和CP-Zn的MALDI-TOF 質譜圖Fig.1 MALDI-TOF mass spectra of CP and CP-Zn

2.3 氨基酸組成分析

表2為CP和CP-Zn的氨基酸組成及比例，CP中總的氨基酸質量分數為88.68%，與表1中檢測的蛋白質量分數較為相近。其中羥脯氨酸為膠原肽的特征氨基酸，其質量分數最高，其次為天冬氨酸和甘氨酸。與鋅螯合后，酸性氨基酸天冬氨酸與谷氨酸在總氨基酸的比例明顯增加，這說明酸性氨基酸具有較強的鋅結合能力，側鏈的羧基很可能是鋅離子的重要螯合位點[18]。螯合鋅中氨基酸的質量分數為81.99%，與表1中檢測的蛋白質量分數基本吻合。

表2 CP和CP-Zn的氨基酸組成及比例 單位：%

2.4 體外抗氧化活性實驗

CP及CP-Zn對DPPH自由基的清除效果如圖2所示，當CP的質量濃度為10 g/L時，對DPPH自由基的清除率約為59.73%，而等質量濃度的CP-Zn對DPPH自由基的清除率約為65.91%，說明CP-Zn對DPPH自由基具有較好的清除效果[19]。經計算可以得出，CP和CP-Zn的IC50值分別為6.30和3.69 g/L。

圖2 CP及CP-Zn對DPPH自由基的清除效果Fig.2 Scavenging effect of CP and CP-Zn on DPPH free radical

CP及CP-Zn對羥自由基的清除效果如圖3所示。CP及CP-Zn對羥自由基都有一定的清除作用，而且清除能力隨樣品濃度的變化而變化[20]。經計算求得CP清除羥自由基的IC50值約為10.51 g/L，而CP-Zn約為6.59 g/L?？梢奀P在與鋅螯合后對羥自由基的清除能力增強。

圖3 CP及CP-Zn對羥自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect of CP and CP-Zn on hydroxyl free radical

CP及CP-Zn的Fe3+還原能力如圖4所示，CP-Zn的Fe3+還原能力高于CP，特別是在質量濃度高于4 g/L時，抗氧化優勢明顯。

圖4 CP及CP-Zn的還原能力Fig.4 Reducing power of CP and CP-Zn

螯合工藝使得CP的抗氧化、還原能力大大提升，這很可能是因為多肽的抗氧化能力與其氨基酸的種類和組成具有一定的相關性，而且具有較強金屬螯合能力的氨基酸往往也表現出良好的抗氧化活性[21]。如谷氨酸、天冬氨酸可以提供酸性氫原子增強肽類物質的還原能力[22]；含咪唑基的組氨酸能夠通過電子的直接轉移抑制自由基[23]；酪氨酸作為芳香族氨基酸可以參與供氫，減慢或終止自由基鏈式反應[24]。當CP與鋅離子螯合后，天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、酪氨酸等氨基酸的比例均有所增加，從而改變了其抗氧化、還原能力。

2.5 抑菌效果

圖5是CP及CP-Zn對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色假絲酵母等4種指示菌的抑菌效果圖。CP對4種指示菌均未表現出抑菌活性，而CP-Zn的抑菌效果良好。螯合鋅對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最為明顯，抑菌圈約為22.0 mm，其次是金黃色葡萄球菌，抑菌圈約為20.1 mm，對白色假絲酵母和大腸桿菌的抑菌圈分別約為17.1 mm和15.2 mm。實驗結果表明CP與鋅離子螯合后能夠增強其抑菌活性，鋅離子的加入對抑菌效果起了關鍵作用[25]。

1-CP-Zn；2-CP a-大腸桿菌；b-金黃色葡萄球菌；c-枯草芽孢桿菌；d-白色假絲酵母圖5 CP及CP-Zn的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of CP and CP-Zn

3 結論

以羅非魚鱗為原料，通過螯合工藝制備了羅非魚鱗膠原肽螯合鋅。MALDI-TOF 質譜圖顯示羅非魚鱗膠原肽為分子質量<1 200的小分子膠原肽，經螯合后，可以檢測到[M-H+Zn]+的準離子峰，說明生成了肽-鋅螯合物。氨基酸分析結果表明羅非魚鱗膠原肽中富含羥脯氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，與鋅離子螯合后，谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸的比例明顯提高。羅非魚鱗膠原肽螯合鋅的抗氧化、還原能力明顯強于膠原肽，螯合后氨基酸組成比例的變化可能是主要原因。羅非魚鱗膠原肽螯合鋅對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色假絲酵母都有較強的抑制作用，而膠原肽無抑菌活性。本試驗結果表明羅非魚鱗膠原肽螯合鋅具有良好的體外抗氧化活性及抑菌活性，這為羅非魚鱗膠原肽螯合鋅的開發應用提供了一定的理論基礎。