慈利和古丈地區酸肉細菌多樣性差異研究及其功能預測

王子媛，宋庭羽，邵毅君，凌霞，侯強川，郭壯*

1(湖北文理學院, 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽，441053)2(襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北 襄陽，441001)

酸肉是采用自然發酵的方式制得的一種特色發酵食品，因其味道獨特、香氣宜人和口感較佳，在湖南省、貴州省和江西省等地廣泛流傳[1]。酸肉的制作流程為將鹽均勻涂抹在生鮮肉上，而后將處理好的鮮肉放入密封性能良好的土陶中，同時加入辣椒、米粉、胡椒和糯米粉等輔料進行密封發酵，發酵完成至少需要2周[2]。近年來，國內學者圍繞酸肉制作工藝進行了諸多優化實驗，其中姜亞[3]得出制作酸肉最優的發酵工藝參數為糯米粉添加量25%、食鹽添加6%、35 ℃發酵60 d；韋誠等[4]通過研究發現發酵周期為50～80 d的酸肉品質最佳；羅珍岑等[5]用乳酸鏈球菌素(Nisin)對酸肉貯藏時間進行了研究，結果顯示Nisin的添加可以顯著延長產品的貯藏時間。微生物類群對發酵食品的品質形成和食用安全性均具有較大的影響[6]，但是目前有關酸肉微生物類群的研究仍相對較少。

經過10多年的發展，高通量測序技術逐漸的被改進并優化，相較于上一代測序技術，其通量更高、測序成本更低且方便易操作[7]，目前該技術被廣泛應用于風干發酵肉[8]、發酵蔬菜[6]以及發酵飲料[9]微生物多樣性解析中。本研究采用MiSeq高通量測序技術對湖南省張家界市慈利縣和湖南省湘西土家族苗族自治州古丈縣酸肉微生物多樣性進行揭示，在對其門屬含量、α多樣性和β多樣性進行比較分析的基礎上，使用BugBase以及PICRUSt軟件對酸肉中細菌表型和所行使的功能進行預測。通過本研究的實施以期為后續酸肉產品品質的改善提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸肉：納入本研究的酸肉樣品共有12 個，依次編號為CL1～CL5和GZ1～GZ7，其中CL1～CL5采集自慈利縣城西市場和柳林農貿市場，GZ1～GZ7采集自古丈縣農貿市場和默戎鎮農貿市場。所有酸肉樣品均以豬肉為原料、切片大小一致且發酵時間為1個月左右。

rTaq酶、脫氧核糖核苷三磷酸、10×聚合酶鏈式反應緩沖液，北京全式金生物技術有限公司；微生物基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；338F/806R正反向引物，武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

R930機架式服務器，美國DELL公司；FluorChem FC3化學發光凝膠成像系統，美國ProteinSimple公司；CR21N型高速離心機，日本日立金屬株式會社；Vetiri梯度基因擴增儀，美國AB公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司；ND-2 000C微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸肉微生物宏基因組提取、16S rRNA序列擴增及高通量測序

使用試劑盒對酸肉中微生物宏基因組DNA進行提取，參照郭壯等[10]的擴增體系及條件對細菌進行PCR擴增，而后將檢測合格且清潔的擴增產物郵寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司，通過MiSeq PE300平臺進行高通量測序。

1.3.2 序列質控及生物信息學分析

使用QIIME平臺對質控后的下機序列進行分析[11]，首次使用PyNAST工具將序列對齊[12]，繼而使用UCLUST算法構建分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)[13]，然后使用ChimeraSlayer工具刪除含有嵌合體的OTU[14]，并從余下的OTU中挑選代表性序列在RDP[15]、Greengenes[16]和SILVA[17]數據庫中進行綜合比對，進而明確酸肉細菌類群的構成和相對含量，緊接著使用FastTree軟件構建系統發育樹[18]，最后對細菌類群的α多樣性和β多樣性進行分析，其中α多樣性指標包含Chao1指數和Shannon指數，β多樣性分析為非加權主坐標分析(principal coordinate analysis，PCoA)和加權非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA)聚類分析。本研究將平均相對含量>1.0%的門和屬定義為優勢門和優勢屬。

1.3.3 BugBase表型及PICRUSt基因功能預測

將OTU數據文件和樣品分類信息文件上傳至BugBase網站(https://bugbase.cs.umn.edu/)進行樣品表型預測[19]；選取序列文件使用PICRUSt工具進行酸肉微生物基因功能預測，同時使用蛋白質直系同源簇數據庫(clusters of orthologous groups of proteins，COGs)對預測的功能進行注釋[20]。

1.3.4 數據分析

使用Past軟件進行Mann-Whitney分析，使用R軟件進行氣泡圖、瀑布圖、相關性圖和熱圖的繪制，使用Origin 2017軟件繪制主坐標分析圖。

2 結果與分析

2.1 酸肉細菌類群測序的基本情況

本研究使用Illumina MiSeq高通量測序技術對采集自慈利和古丈地區的酸肉細菌多樣性進行了解析，其測序產出序列信息如表1所示。

表1 測序深度、序列比對情況和α多樣性指標Table 1 Sequencing depth, sequence alignment and α diversity index

由表1可知，12 個酸肉經測序共得到402 138 條高質量序列，其中有23 條序列比對失敗，因此共有402 115 條高質量序列參與OTU的構建，按照97%相似度對序列進行劃分，去除嵌合體序列后，得到17 088個OTU，并將其劃分為9 個門、16 個綱、38 個目、59 個科和98 個屬。由表1亦可知，GZ5的Chao1和Shannon指數均為最高，其數值分別為2 289和7.19，說明GZ5的群落豐度及多樣性較其他酸肉均為最高。經Mann-Whitney檢驗發現，慈利地區酸肉細菌類群的Chao1和Shannon指數均顯著偏低(P<0.05)，這說明其菌群豐度和多樣性均低于古丈地區酸肉。

2.2 酸肉細菌類群各分類學地位的含量及差異分析

由圖1-a可知，慈利地區酸肉中平均相對含量>1.0%的細菌門有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，平均相對含量分別為93.86%、2.92%和2.63%；古丈地區酸肉中平均相對含量>1.0%的細菌門僅有Firmicutes，平均相對含量為99.07%。經Mann-Whitney檢驗發現，慈利地區酸肉中Firmicutes的含量顯著偏低(P<0.05)，而其他細菌門的含量在不同地區酸肉中差異不顯著(P>0.05)。

由圖1-b可知，慈利地區酸肉中平均相對含量>1.0%的細菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)，平均相對含量分別為40.23%、44.35%、7.94%、2.40%和1.64%；古丈地區酸肉中平均相對含量>1.0%的細菌屬為Lactobacillus、Staphylococcus、Weissella、Lactococcus(乳球菌屬)和Macrococcus(巨型球菌屬)，平均相對含量分別為62.61%、5.18%、22.79%、3.65%和1.33%。經Mann-Whitney檢驗發現，慈利地區酸肉中Lactococcus的含量顯著低于古丈地區(P<0.05)，分別為0.05%和3.65%，而其他細菌屬的含量差異則不顯著(P>0.05)。

a-門水平；b-屬水平圖1 基于門和屬水平的酸肉細菌類群構成分析Fig.1 Bacterial taxa composition analysis of sour meat based on phylum and genus levels

此外，Lactobacillus和Weissella在慈利和古丈地區酸肉中的累計平均相對含量分別為48.17%和85.40%，且古丈地區酸肉中亦含有3.65%的Lactococcus。通過研究云南地區酸肉細菌類群構成，米瑞芳等[21]發現Lactobacillus、Weissell和Lactococcus為其優勢菌屬，平均相對含量分別為53.68%、22.31%和8.63%。由此可見，由于不同地區的酸肉均以豬肉為原料，并采用厭氧發酵制作而成，因此為乳酸菌的生長創造了有利的環境，進而促使其成為了優勢細菌類群。乳酸菌可使酯類物質含量明顯增加，進而提升了酸肉的風味品質[22]。除酸肉外，臘肉亦是湖北和湖南地區較為常見的發酵肉制品，采用高通量測序技術，董蘊等[23]對恩施地區臘肉的菌群多樣性進行了解析，結果發現其蘊含的細菌類群主要為Staphylococcus、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)。酸肉和臘肉細菌類群存在明顯差異的原因可能在于兩者的制作工藝不同，臘肉為開放式發酵，且增加了煙熏等操作工藝[24]。

若某一OTU存在于所有12 個酸肉樣品中，則將其定義為核心OTU，本研究共發現了6 個核心OTU，其平均相對含量及注釋結果如圖2所示。

圖2 核心OTU平均相對含量的瀑布圖Fig.2 Waterfall plot representing the average relative content of core OTUs

由圖2可知，6 個核心OTU分別為OTU1407(Staphylococcus)、OTU3714(Lactobacillus)、OTU13870(Weissella)、OTU6884(Lactococcus)、OTU366(Corynebacterium)和OTU9607(Macrococcus)，其平均相對含量分別為14.89%、5.01%、1.79%、1.62%、0.99%和0.63%，累計平均相對含量達24.9%。由此可見，2個地區制作的酸肉共有部分細菌類群，這與屬水平上的研究結果一致。Staphylococcus和Macrococcus均隸屬于葡萄球菌科(Staphylococcaceae)[25]，有研究發現Staphylococcus具有降低廣式臘腸中亞硝酸鹽含量的作用[26]，而隸屬于Macrococcus的M.caseolyticus(溶酪大球菌)則可以加快廣式臘腸中脂肪和蛋白質的氧化與風味的降解[27]，因而劃分到OTU1407和OTU9607的細菌類群對酸肉品質的形成可能具有積極的意義。值得一提的是，部分隸屬于Staphylococcus的細菌類群還具有潛在的致病性，如AN等[28]研究發現，S.epidermidis(表面葡萄球菌)可導致脂溢性皮炎的發生，BUBECK WARDENBURG等[29]研究發現S.aureus(金黃色葡萄球菌)可導致肺炎，嚴重情況下甚至還能導致死亡，因此在后續研究中積極開展隸屬于Staphylococcus菌株的篩選和安全性評價，對酸肉制品的產業化推動具有積極的意義。

進一步分析發現，OTU10585(芽孢桿菌屬)僅存在于5 個慈利地區酸肉樣品中，但其相對含量均低于0.1%，何江紅等[30]研究發現Bacillus在川藏牦牛酸肉中具有較強的產蛋白酶和淀粉酶能力，由于酸肉制作過程中常加入糯米粉或米粉為原料，因而推測劃分到OTU10585的細菌可能會通過分解蛋白質和淀粉進而對酸肉的品質產生影響。此外，本研究沒有發現有OTU僅存在于7 個古丈地區酸肉樣品中。為進一步解析核心細菌類群間的互作關系，本研究對核心OTU的相關性進行了分析，其結果如圖3所示。OTU13870(Weissella)和OTU366(Corynebacterium)之間呈現顯著正相關(P<0.05)，且其相關系數為0.92，由此推測隸屬于Weissella與Corynebacterium的細菌類群在酸肉中可能存在一定的共生關系。

圖3 核心OTU的相關性分析Fig.3 Correlation analysis of core OTUs注：圓圈顏色越深且直徑越大，表明其相關系數越大

2.3 兩個地區酸肉細菌類群的β多樣性分析

本研究進一步采用非加權PCoA和加權UPGMA聚類分析對2個地區酸肉細菌類群的β多樣性進行解析，其結果如圖4所示。由圖4-a可知，2個地區制作的酸肉樣品在空間排布上呈現出分離趨勢，其中慈利地區樣品主要分布在2、3象限，而古丈地區樣品分布在1、2、4象限。圖4-b的結果亦呈現出相似的現象，這說明2個地區的酸肉細菌群落結構存在一定差異。

a-非加權PCoA;b-加權UPGMA聚類分析圖4 非加權PCoA和加權UPGMA聚類分析Fig.4 Unweighted PCoA and weighted UPGMA clustering analysis

2.4 酸肉細菌類群的表型預測及功能預測分析

本研究使用BugBase對2個地區酸肉細菌類群的表型進行了預測，結果如圖5所示。

由圖5可知，2個地區酸肉細菌類群在好氧、移動原件含量、生物膜形成、氧化脅迫耐受、革蘭氏陽性、革蘭氏陰性和致病潛力等表型上無顯著差異(P>0.05)，而在厭氧和兼性厭氧表型上分別有顯著(P<0.05)和非常顯著差異(P<0.01)，這說明慈利地區酸肉細菌類群中厭氧細菌的相對含量顯著高于古丈地區(P<0.05)，而兼性厭氧型細菌的相對含量則呈現相反的趨勢(P<0.01)。本研究進一步對酸肉細菌類群的基因功能進行了預測，其結果如圖6所示。

a-厭氧；b-好氧；c-移動原件含量；d-兼性厭氧；e-生物膜形成；f-氧化脅迫耐受；g-革蘭氏陽性；h-革蘭氏陰性；i-致病潛力圖5 慈利和古丈地區酸肉細菌類群的表型預測Fig.5 Phenotypic prediction of sour meat samples from Cili and Guzhang regions注：*代表差異顯著(P<0.05)，**代表差異非常顯著(P<0.01)

由圖6可知，慈利和古丈地區酸肉細菌類群在“氨基酸轉運與代謝”、“碳水化合物運輸與代謝”和“翻譯、核糖體結構與生物發生”功能上的相對含量較高，這說明2個地區酸肉細菌類群可能在自身代謝相關功能上表達較高。經Mann-Whitney分析發現，2個地區酸肉細菌類群在各功能上的表達差異均不顯著(P>0.05)。

3 結論

使用高通量測序技術解析發現，慈利和古丈地區酸肉中的細菌類群主要由Lactobacillus、Staphylococcus和Weissella構成，主要為厭氧菌或兼性厭氧菌，且細菌類群在“氨基酸轉運與代謝”、“碳水化合物運輸與代謝”以及“翻譯、核糖體結構與生物發生”等自身代謝相關功能上表達較高。同時，通過研究2個地區的酸肉發現，不同地區制作的酸肉細菌類群多樣性存在一定的差異。