不同發(fā)酵方式對柚皮泡菜理化特性和風味的影響

李俊健，高杰賢，林錦銘，黎攀，杜冰,2*

1(華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州，510642)2(嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室，廣東 廣州，510642)

柚子，蕓香科柑橘屬一個重要的商業(yè)品種，在我國南方各省均有栽培[1]。除了被當作鮮食水果，柚子目前還被加工成果醬[2]、果脯[3]、飲料[4]等，而約占柚果30%～50%的柚皮作為主要加工副產(chǎn)物則常被丟棄或掩埋，既浪費資源又造成環(huán)境污染。現(xiàn)代科學研究表明，柚皮里含有豐富的類黃酮、膳食纖維、精油等成分[5]，具有降血脂、降血糖、止咳平喘等功效[6-8]。泡菜是我國的傳統(tǒng)食品，它主要以果蔬為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，達到延長保藏時間、增進風味的效果[9-10]。將柚皮加工成泡菜，不僅能保留柚皮特有的香氣和功能，而且還能提高柚皮的風味及口感，顯著提高其附加價值。

目前，關(guān)于柚皮經(jīng)發(fā)酵加工成食品已有部分研究報道：俞耀茹等[11]研究開發(fā)了柚子酸奶，最佳工藝條件下制備的酸奶顏色微黃、有獨特的柚子風味；游劍等[12]研制的風味型柚子果醋口感酸爽、滋味純正。然而，對于柚皮接種發(fā)酵的研究報道較少，將接種發(fā)酵技術(shù)運用于柚皮泡菜中還未見報道。傳統(tǒng)泡菜制作多以小作坊或家庭式生產(chǎn)為主，自然發(fā)酵的模式常出現(xiàn)雜菌污染、風味不穩(wěn)定、發(fā)酵周期過長等問題，嚴重限制了泡菜生產(chǎn)工業(yè)化標準化的進程[13]。有研究發(fā)現(xiàn)接種發(fā)酵可以保證泡菜質(zhì)量的穩(wěn)定性、縮短發(fā)酵周期、降低亞硝酸鹽含量[14]。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是目前工業(yè)化泡菜生產(chǎn)使用和研究最普遍的菌株，其發(fā)酵以生成乳酸為主，在泡菜發(fā)酵的中后期占主導地位[10]；乳酸芽孢桿菌(Bacillussp.)DU-106篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪，具有耐酸和產(chǎn)酸能力強的特點，目前已被廣泛應用于各類發(fā)酵食品的制作，顯示出良好的發(fā)酵性能[15-17]。因此研究比較不同發(fā)酵方式對柚皮發(fā)酵泡菜品質(zhì)、亞硝酸鹽含量控制和風味的影響具有非常重要的意義。

基于此，本研究通過比較不同發(fā)酵方式處理的柚皮泡菜發(fā)酵期間的pH、總酸、亞硝酸鹽含量及發(fā)酵成熟后游離氨基酸組成及揮發(fā)性成分，為美味可口、品質(zhì)安全穩(wěn)定、風味特征明顯的新型柚皮泡菜生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白肉蜜柚皮，由廣東省梅州市大埔縣順興種養(yǎng)股份有限公司提供；乳酸芽孢桿菌DU-106和植物乳桿菌，菌粉濃度為1012CFU/g，由華南農(nóng)業(yè)大學新資源與功能性原料研究及評價中心鑒定及保藏；氫氧化鈉、鹽酸、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、5-磺基水楊酸(均為分析純)，廣州化學試劑廠；亞硝酸鈉標準溶液(200 μg/mL)，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PHs-3C pH計，上海精密科學儀器有限公司；UV-1100紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；DHP600電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；L-8900全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柚皮泡菜的制備

將柚皮洗凈、切分后，按柚皮∶鹽涼開水(4%質(zhì)量分數(shù))=1∶2的質(zhì)量比裝入泡菜壇，再添加2%(質(zhì)量分數(shù))白砂糖攪拌均勻，按柚皮質(zhì)量的0.1%分別添加乳酸芽孢桿菌DU-106和植物乳桿菌，于25 ℃下密封發(fā)酵。對照組為未接種自然發(fā)酵，發(fā)酵工藝與接種發(fā)酵組相同。每種處理設3組平行，密封發(fā)酵168 h，每隔24 h采樣測定相關(guān)指標。

1.3.2 pH和總酸的測定

使用pH計對泡菜液直接測定。泡菜液總酸參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》進行測定，折算系數(shù)以乳酸0.090計。

1.3.3 亞硝酸鹽的測定

柚皮泡菜中亞硝酸鹽的測定參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，采用鹽酸萘乙二胺法。

1.3.4 游離氨基酸的測定

取發(fā)酵第7天泡菜液1 mL于離心管中，加入3 mL體積分數(shù)為5%磺基水楊酸溶液，振蕩混勻后靜置1 h，于12 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液采用日立L-8900全自動氨基酸分析儀進行測定。

1.3.5 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

稱取5 g發(fā)酵第7天樣品置于50 mL頂空瓶中，加蓋密封，60 ℃水浴平衡10 min后將65 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中吸附40 min，萃取后將纖維頭插入氣相色譜系統(tǒng)解吸3 min，解吸溫度250 ℃。

GC-MS條件：毛細管柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；前進樣口溫度250 ℃；載氣(He)流速1.0 mL/min；不分流模式進樣；升溫程序：初始柱溫50 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至260 ℃，再以10 ℃/min升至280 ℃并保持5 min。離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；離子化方式EI；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z30～450。

數(shù)據(jù)分析：將質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計算機在NIST 14譜庫檢索，結(jié)合手動檢索校對，選取匹配度>800(最大值為1 000)的成分作為定性結(jié)果。

1.3.6 感官評定

由通過感官分析培訓的食品專業(yè)人員20名(男10名，女10名)組成感官評價小組對柚皮泡菜進行感官評定，分別從色澤、香氣、滋味和總體可接受度進行評價，感官評分標準如表1所示。

表1 柚皮泡菜感官評定表Table 1 Sensory evaluation standards of pomelo peel pickles

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜發(fā)酵過程中pH和總酸的變化

pH和總酸的變化與泡菜的品質(zhì)密切相關(guān)，是泡菜發(fā)酵過程中重要的理化指標[18]，柚皮泡菜發(fā)酵過程中的pH和總酸變化如圖1所示。由圖1-A可知，自然發(fā)酵組與接種組的pH變化趨勢一致，所有組的柚皮泡菜在發(fā)酵前期pH迅速下降，后期逐漸穩(wěn)定在3.5～4.0，接種組的下降速率比自然發(fā)酵組快，其中DU-106組在發(fā)酵24 h后pH已下降至4.0左右。這是因為接種組初始乳酸菌含量豐富，在發(fā)酵初期就能大量產(chǎn)酸，導致pH迅速下降；到達發(fā)酵后期時，進入穩(wěn)定期，pH逐漸穩(wěn)定，這與任亭等[19]的研究結(jié)果一致。由圖1-B可知，各組總酸變化趨勢相同，其中DU-106組的總酸在整個發(fā)酵過程中均明顯高于自然發(fā)酵組和植物乳桿菌組，并在第7天達到最大值1.98 g/kg，表明乳酸芽孢桿菌DU-106能更快的適應此發(fā)酵體系，產(chǎn)酸能力更強。

A-泡菜發(fā)酵過程中pH的變化;B-泡菜發(fā)酵過程中 總酸的變化圖1 柚皮泡菜發(fā)酵過程中pH和總酸的變化Fig.1 Changes of pH and titratable acidity in pomelo peel pickles during the fermentation注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化

亞硝酸鹽是一種廣泛存在于泡菜中的致癌物質(zhì)，其含量高低是判斷泡菜是否能安全食用的一個重要指標[20]。柚皮泡菜發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽含量變化如圖2所示。

由圖2可知，接種組泡菜在整個發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量均低于自然發(fā)酵組；3種發(fā)酵方式的泡菜在48或72 h時達到“亞硝峰”，其中自然發(fā)酵組的“亞硝峰”最高，含量達到7.7 mg/kg；DU-106組的“亞硝峰”最低，含量為2.7 mg/kg。在發(fā)酵初期，自然發(fā)酵組中的乳酸菌少而pH高，黃桿菌和革蘭氏陰性菌等雜菌將柚皮體內(nèi)的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，形成“亞硝峰”[21]；隨著發(fā)酵進行乳酸菌成為優(yōu)勢菌群，其產(chǎn)生亞硝酸鹽降解酶從而使亞硝酸鹽含量下降。而接種組在發(fā)酵初期就含有大量乳酸菌，同時較低的pH也有利于亞硝酸鹽的降解和抑制雜菌生長[22]。這表明接種乳酸菌有利于降低柚皮泡菜的亞硝酸鹽含量，3種發(fā)酵方式的柚皮泡菜亞硝酸鹽含量均低于國家標準限量(20 mg/kg)，滿足泡菜食用安全性的要求。

圖2 柚皮泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.2 Changes of nitrate in pomelo peel pickles during the fermentation

2.3 泡菜發(fā)酵終點時游離氨基酸含量變化分析

游離氨基酸是評價食品風味的一項重要指標，其含量高低會直接影響食品的風味和口感[23]。3種不同發(fā)酵方式的柚皮泡菜在發(fā)酵終點時，一共檢測出了14種氨基酸，其中有6種必需氨基酸和8種非必需氨基酸，種類和含量具體如表2所示。

表2 柚皮泡菜發(fā)酵終點時的游離氨基酸含量 單位：μg/mL

在發(fā)酵終點時，游離氨基酸總含量由高到低順序為DU-106發(fā)酵>自然發(fā)酵>植物乳桿菌發(fā)酵；DU-106組的泡菜液中有14種氨基酸，且氨基酸總量達到了10.35 μg/mL，必需氨基酸總量達到了2.21 μg/mL，均顯著高于其他2組；推測乳酸芽孢桿菌DU-106在發(fā)酵過程中產(chǎn)蛋白酶較為豐富[24]，促進了柚皮中蛋白質(zhì)的降解，同時pH的迅速降低有利于抑制其他雜菌生長，減少雜菌利用氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)繁殖，從而提高游離氨基酸的含量。依據(jù)氨基酸對滋味的貢獻，本試驗14種氨基酸中包括了6種甜味氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、組氨酸)、2種鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和6種苦味氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸)[25]，DU-106組的甜味氨基酸、鮮味氨基酸和苦味氨基酸含量均高于其他2組，且苦味氨基酸由于閾值較高，容易被泡菜的酸味和咸味所掩蓋不易嘗出，由此接種乳酸芽孢桿菌DU-106更有利于提升柚皮泡菜的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值。

2.4 泡菜發(fā)酵終點時揮發(fā)性風味物質(zhì)變化分析

揮發(fā)性香氣是發(fā)酵食品的重要品質(zhì)之一，是影響消費者接受程度和偏好的重要因素[26]。采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對3種不同發(fā)酵方式的柚皮泡菜進行分析，如表3所示，共測得74種揮發(fā)性物質(zhì)，其中包括烯烴類43種，醇類16種，酯類5種，醛類7種及酮類3種。自然發(fā)酵、DU-106和植物乳桿菌發(fā)酵泡菜分別檢測出香氣物質(zhì)56、52和49種，D-檸檬烯和月桂烯的相對含量最高，分別為52.170%、20.578%，52.925%、10.174%、53.739%和23.275%；這2種烯烴類具有柑橘和甜香味，是柚皮原料本身的特征香氣。

表3 不同發(fā)酵方式對柚皮泡菜揮發(fā)性成分含量的影響Table 3 Effects of different fermentation methods on volatile components of pomelo peel pickles

續(xù)表3

對于柚皮泡菜來說，雖然烯烴類是最豐富的成分，但由于醛、酯和醇等其他物質(zhì)閾值較低，因而它們也是柚皮泡菜香氣的重要貢獻者。自然發(fā)酵組揮發(fā)性成分相對含量較高的有醇類，其相對含量達5.008%，主要原因是自然發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)復雜，酵母菌的代謝旺盛積累了大量醇類物質(zhì)[27]。DU-106組和植物乳桿菌組中含量較高的是酯類和醛類；接種乳酸菌后其他類型微生物的生長繁殖被抑制，乳酸菌產(chǎn)生的中間產(chǎn)物如醛類較為豐富[28]；同時大量產(chǎn)生的酸可與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應使酯類物質(zhì)的種類及含量增加，酯類物質(zhì)具有的花香和果香有助于進一步豐富泡菜的風味。

2.5 泡菜發(fā)酵終點時感官分析

不同方式發(fā)酵的柚皮泡菜感官評定結(jié)果如表4所示。從色澤上來看，2組接種發(fā)酵的柚皮泡菜色澤均勻，呈柚皮獨特的金黃色，自然發(fā)酵組呈白黃色，差異較為明顯。3種發(fā)酵方式的柚皮泡菜在香氣上得分差別不大，均有特有的柚皮和發(fā)酵香氣，無其他異味。從滋味和體態(tài)來看，DU-106發(fā)酵組泡菜滋味協(xié)調(diào)、酸咸適中、無發(fā)軟變質(zhì)；自然發(fā)酵組發(fā)軟嚴重，口感不佳。綜合得分從高到低為DU-106發(fā)酵泡菜>植物乳桿菌發(fā)酵泡菜>自然發(fā)酵泡菜。DU-106發(fā)酵泡菜是3個發(fā)酵組中感官品質(zhì)最好的；自然發(fā)酵組其色澤、滋味、體態(tài)感官品質(zhì)較接種發(fā)酵組差。

表4 柚皮泡菜的感官評價 單位：分

3 結(jié)論

本實驗探究了不同發(fā)酵方式對柚皮泡菜發(fā)酵過程中pH、總酸和亞硝酸鹽的變化及對泡菜風味的影響。與自然發(fā)酵相比，接種乳酸芽孢桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵能顯著加快pH的下降速度，維持較高的總酸含量，降低泡菜中亞硝酸鹽的含量，縮短發(fā)酵周期。

乳酸菌發(fā)酵后的泡菜香氣成分種類及相對含量與自然發(fā)酵組差異不大，但從游離氨基酸含量和感官分析而言，接種乳酸芽孢桿菌DU-106組最優(yōu)，其在游離氨基酸含量、滋味和體態(tài)方面都比其他2組有所改善。本研究為柚皮泡菜的生產(chǎn)研究和純種發(fā)酵技術(shù)提高泡菜質(zhì)量提供了前期的基礎(chǔ)和理論依據(jù)。