響應面優化開菲爾藜麥發酵乳及其抗氧化分析

陳樹俊，王婉榕

(山西大學 生命科學學院，山西 太原，030006)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥，山西靜樂；沙棘原漿，山西廈普賽爾食品飲料股份有限公司；黃桃濃漿、胡蘿卜濃漿，福建臻富果汁食品有限公司；開菲爾乳桿菌(ZKCC-378)，北京中科質檢生物技術有限公司；α淀粉酶(3 700 U/g)、β淀粉酶(102 000 U/g)、胃蛋白酶(3 000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg),北京索萊寶生物科技有限公司；DPPH等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JYL-C010料理機，九陽股份有限公司；XL-600B多功能粉碎機，小寶電器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；HHS-11-6電熱恒溫水浴鍋、YXQ-LS-75Ⅱ全自動高壓滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HPS-250生化培養箱，哈爾濱市東明醫療儀器廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；FE20實驗室pH計，上海梅特勒托利多儀器有限公司；SCIENTZ-10 N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗流程

實驗流程如下：

藜麥種子→萌發→磨漿→糊化→液化→糖化→殺菌→發酵→藜麥發酵乳、混合果蔬汁調配后，真空冷凍干燥→體外胃腸消化模擬→抗氧化分析

1.3.2 藜麥漿的制備

藜麥種子在22 ℃的恒溫培養箱中萌發34 h，期間每6 h澆1次蒸餾水[14]，結束后在-20 ℃保存24 h，在45 ℃烘干11 h，粉碎過篩，得到藜麥芽粉；藜麥粉以1∶5(g∶mL)的料液比進行磨漿(保證藜麥濃漿的蛋白質質量分數>2.5%)；糊化的實驗條件為80 ℃、30 min，使其達到糊化的終點；通過正交試驗確定液化和糖化過程的實驗條件分別為75 ℃、55 min、α淀粉酶18 U/g和55 ℃、90 min、β淀粉酶240 U/g，從而制得藜麥濃漿。

1.3.3 發酵

1.3.3.1 殺菌、冷卻

將制好的藜麥濃漿，90 ℃殺菌20 min后冷卻[15]。

1.3.3.2 菌種活化稀釋

將開菲爾乳桿菌凍干粉用少量無菌水稀釋后，滴加至平板培養基，37 ℃培養48 h。活化后用接種環取少量菌至液體培養基中，反復接種活化后至活菌總數約為109CFU/mL，作為菌種接種液備用。

1.3.3.3 接種、發酵

藜麥濃漿殺菌后，接入開菲爾乳桿菌，在恒溫培養箱中培養一定時間后，測其酸度和活菌數。

1.3.4 單因素試驗

以酸度和活菌數為評價指標，考察接種量(2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)、發酵時間(9、10、11、12、13、14、15 h)、發酵溫度(34、35、36、37、38、39、40 ℃)對藜麥濃漿發酵效果的影響。

1.3.5 響應面優化試驗

基于單因素試驗結果，依據Box-Behnken試驗設計原理，考察3因素之間的交互作用并得到開菲爾發酵藜麥的最優條件。以活菌數和酸度為響應值，設計3因素3水平的試驗見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Codes and levels of response surface test

1.3.6 果蔬發酵乳的復配

以感官評分和固形物含量為評價指標，確定果蔬-開菲爾藜麥發酵混合乳的比例為藜麥發酵乳50 g、沙棘原漿13 g、黃桃濃漿30 g和胡蘿卜濃漿10 g。

1.3.7 真空冷凍干燥工藝

將藜麥濃漿、開菲爾藜麥發酵乳和果蔬-開菲爾藜麥發酵混合乳3組在-43 ℃的條件下冷凍2 h后脫模，設置加熱板溫度為45 ℃、干燥倉內真空度10 Pa。

1.3.8 體外胃腸消化模擬試驗

胃消化模擬試驗[16-17]：將藜麥濃漿、開菲爾藜麥發酵乳和果蔬-開菲爾藜麥發酵混合乳進行適度稀釋，加入1 mol/L HCl溶液使pH至2.0，加入200 U胃蛋白酶進行胃消化過程，每隔1 h取樣、共4次，離心后測定消化及抗氧化指標。

腸消化模擬試驗：取胃消化4 h的樣品，緩慢加入1 mol/L NaHCO3溶液調pH至7.8，加入200 U胰蛋白酶進行腸消化過程，每隔1 h取樣、共5次，離心后測定消化及抗氧化指標。

1.3.9 相關指標測定

1.3.9.1 活菌數和酸度的測定

參照標準[18-19]，分別進行活菌數和酸度的測定。

1.3.9.2 黃酮和多酚的測定

依據參考文獻[20-21]，分別在510和765 nm 處對黃酮和多酚進行測定。

1.3.9.3 抗氧化能力的測定

依據參考文獻[22]，在517和320 nm處分別進行DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除率的測定；依據參考文獻[23]，在510和700 nm處分別進行羥自由基清除率和鐵還原力的測定。

1.4 數據處理

每組試驗重復3次，數據均為平均值。實驗圖表用Origin 8.0繪制，使用SPSS 17.0和Design-Expert 8.0.6進行顯著性統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 接種量對開菲爾發酵藜麥效果的影響

接種量對發酵效果的影響見圖1，隨著接種量的增加，酸度、活菌數均先上升后趨于平緩，原因可能是接種量的大小與開菲爾菌在藜麥漿體系中的生長有很大的關系，當開菲爾菌的接種量<5%時，藜麥漿中的活菌數隨之減少，導致藜麥漿沒有充分發酵，造成藜麥漿原料的浪費；當開菲爾菌的接種量>5%時，藜麥漿所能利用的活菌數是有限的，造成酸度幾乎無明顯變化。所以，綜合接種量對酸度和活菌數的影響程度，選擇接種量為5%進行后續試驗。

圖1 接種量對酸度和活菌數的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on acidity and the number of viable bacteria

2.1.2 發酵時間對開菲爾發酵藜麥效果的影響

發酵時間對發酵效果的影響見圖2，隨著發酵時間的延長，活菌數、酸度變化均先上升后趨于平緩，原因可能是將開菲爾菌加入到藜麥濃漿后，菌體大量生長繁殖產酸，使得藜麥芽濃漿環境酸化，適宜的酸度有利于提高活菌數，使酸度增大。當發酵到12 h時，碳源的大量消耗和乳酸的堆積阻礙了開菲爾菌的生長，從而形成活菌數變化不明顯的現象。所以，綜合發酵時間對酸度和活菌數的影響程度，選擇發酵時間為12 h進行后續試驗。

圖2 發酵時間對酸度和活菌數的影響Fig.2 Effect of fermentation time on acidity and the number of viable bacteria

2.1.3 發酵溫度對開菲爾發酵藜麥效果的影響

發酵溫度對發酵效果的影響見圖3，當發酵溫度為 34～37 ℃時，開菲爾菌的活菌數和酸度增長較快，當發酵溫度高于37 ℃，開菲爾菌的活菌數和酸度幾乎無明顯變化，原因可能是溫度的影響對于開菲爾發酵來說是至關重要的，溫度的持續增加不利于開菲爾菌的生長，而開菲爾菌活菌數的穩定進而會影響產酸效果。所以，綜合發酵溫度對酸度和活菌數的影響程度，選擇發酵溫度為37 ℃進行后續試驗。

圖3 發酵溫度對酸度和活菌數的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on acidity and the number of viable bacteria

2.2 開菲爾發酵藜麥濃漿響應面優化結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果

依據表2的實驗數據，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行回歸分析，建立開菲爾發酵藜麥乳酸度和活菌數的二次多項回歸方程如下：

Y1=85.25+0.54A+0.74B+1.09C+0.33AB+0.17AC+0.60BC-1.50A2-1.36B2-1.72C2(R12=96.47%)

Y2=9.28+0.075A+0.17B+0.29C+0.025AB-0.050AC+0.050BC-0.22A2-0.30B2-0.38C2(R22=99.24%)

試驗方差結果如表3所示，模型均極顯著(P<0.000 1)，F值為1.36和0.87，P值為 0.375 8和0.527 1(P>0.05)，表示失擬項不顯著；R12為 96.47%、R22為99.24%，表示模型擬合度較高，可用于預測試驗結果。根據F值大小，表明3個因素對藜麥乳發酵效果影響的主次順序均為C>B>A。由P值可得，B、C、A2、B2和C2對酸度和活菌數均極顯著(P<0.01)，A對酸度和活菌數影響分別為顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)，BC對活菌數影響極顯著(P<0.01)。

3個因素交互作用對酸度和活菌數的影響如圖4所示，以開菲爾菌接種量、發酵時間和發酵溫度分別為中心水平時，酸度和活菌數均呈先上升后趨于平緩的趨勢，發酵溫度的大幅度升高致使產生大量乳酸，使得發酵體系的pH降低，不利于開菲爾菌的生長，故發酵過程趨于穩定，酸度無明顯變化、活菌數略有所降低。由圖4-a、圖4-c、圖4-d和4-f可知，發酵溫度響應面曲面陡于其余兩因素曲面，說明發酵溫度對發酵效果的影響最大，與方差分析結果一致。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface test

表3 方差分析結果Table 3 The results of variance analysis

a-發酵溫度與發酵時間對酸度的影響;b-發酵時間 與接種量對酸度的影響;c-發酵溫度與接種量對酸度 的影響;d-發酵溫度與發酵時間對活菌數的影響;e-發酵 時間與接種量對活菌數的影響;f-發酵溫度與接種量對 活菌數的影響圖4 三因素交互作用對酸度和活菌數的影響Fig.4 Effect of interaction of three factors on acidity and the number of viable bacteria

2.2.2 最佳發酵工藝的確定

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析可得,發酵溫度37.39 ℃、接種量5.21%、發酵時間12.35 h為最佳開菲爾發酵工藝條件。在此條件下，開菲爾藜麥發酵乳的酸度理論值為85.672 4 °T，活菌數對數值為9.367 93 lgCFU/mL。以試驗可操作性為前提，設置工藝條件為發酵溫度 37.4 ℃、接種量 5.2%、發酵時間12.4 h。為了檢驗響應面優化實驗結果的準確性與可靠性，利用最優發酵條件進行3次重復性試驗，實際測得藜麥漿的發酵酸度為85.62 °T(標準差值為1.394)，活菌數對數值為9.33 lgCFU/mL(標準差值為0.027)，其相對誤差<0.05，說明該回歸模型的擬合度較高，可以利用其優化藜麥漿的開菲爾發酵工藝。

2.3 體外消化模擬試驗結果

2.3.1 黃酮和多酚含量的動態分析

消化過程中藜麥濃漿未發酵組、開菲爾藜麥發酵乳組和果蔬-開菲爾藜麥發酵乳混合組的黃酮和多酚變化如圖5所示，由圖5-a可知，藜麥濃漿未發酵組、開菲爾藜麥發酵乳組、果蔬-開菲爾藜麥發酵乳混合組消化后的黃酮含量分別為0.748、0.779、0.853 mg/mL，較消化前分別提高了0.605、0.555、0.515 mg/mL，存在顯著性差異(P<0.05)；由圖5-b可知，藜麥濃漿未發酵組、開菲爾藜麥發酵乳組、果蔬-開菲爾藜麥發酵乳混合組消化后的多酚含量分別為3.256、8.487、10.361 mg/mL，較消化前分別提高了2.760、7.498、8.438 mg/mL，存在顯著性差異(P<0.05)。發酵和消化過程促進樣品黃酮和多酚的釋放使得其含量有所增加，主要原因可能是發酵產生的代謝產物進一步形成酚類物質[24]；蛋白酶和胰蛋白酶通過影響共價鍵的生成與斷裂，使得黃酮類物質含量有所提高[25]。

a-黃酮含量；b-多酚含量圖5 體外消化過程中黃酮和多酚含量的動態分析Fig.5 Dynamic analysis of flavonoids and polyphenols content during in vitro digestion

2.3.2 抗氧化結果分析

由圖6可知，藜麥濃漿未發酵組、開菲爾藜麥發酵乳組和果蔬-開菲爾藜麥發酵乳混合組的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率及鐵還原力隨時間的變化呈增長趨勢。對于藜麥濃漿未發酵組而言，經過消化后其DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率及鐵還原力為74.7%、53.5%、53.3%和0.602，較消化前分別提高了15.6%、15.1%、10.1%和0.152，存在顯著性差異(P<0.05)；對于開菲爾藜麥發酵乳組而言，經過消化后其DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率及鐵還原力為80.8%、59.2%、61.0%和0.689，較消化前分別提高了15.7%、16.9%、11.6%和0.171，存在顯著性差異(P<0.05)；對于果蔬-開菲爾藜麥發酵乳混合組而言，經過消化后其DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率及鐵還原力為85.6%、61.1%、65.1%和0.711，較消化前分別提高了13.8%、15.7%、11.4%和0.153，存在顯著性差異(P<0.05)。在消化過程中，自由基清除率強弱順序為果蔬-開菲爾藜麥發酵乳混合組、開菲爾藜麥發酵乳組、藜麥濃漿未發酵組，且各自抗氧化性均有所增強，原因可能是在發酵過程中，乳酸菌產生的代謝產物使得酚類物質由結合狀態轉變為游離狀態，且有機酸的生成有效阻止了酚類物質的進一步分解[26]；在消化過程中，酶通過水解蛋白質，從而使得與其結合的黃酮類物質進一步增多，而酚類和黃酮類物質是影響抗氧化特性的重要活性物質，故其抗氧化特性有所增加。

a-DPPH自由基清除率;b-羥自由基清除率;c-鐵還原力;d-超氧陰離子自由基清除率圖6 體外消化過程中抗氧化能力的動態分析Fig.6 Dynamic analysis of antioxidant capacity during in vitro digestion

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過響應面優化得出接種量5.2%、發酵時間12.4 h和發酵溫度37.4 ℃為最佳工藝條件。通過體外消化模擬，對藜麥濃漿未發酵組、開菲爾藜麥發酵乳組和果蔬-開菲爾藜麥發酵乳混合組的多酚含量、黃酮含量和抗氧化性的動態變化進行分析，結果表明，經過消化后，3組的黃酮含量和多酚含量明顯升高；果蔬-開菲爾藜麥發酵乳混合組的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率及鐵還原力比藜麥漿未發酵組分別高10.9%、7.6%、11.8%、0.190，比開菲爾藜麥發酵乳組分別高4.8%、1.9%、4.1%、0.022，且果蔬-開菲爾藜麥發酵乳混合組>開菲爾藜麥發酵乳組>藜麥濃漿未發酵組，故可知發酵和果蔬汁的加入均提高了藜麥濃漿的抗氧化特性，為開菲爾菌在谷物、果蔬領域的進一步研究應用奠定了扎實的基礎。