氣相色譜-串聯質譜法測定花椒中氯菊酯的不確定度評定

袁新躍，胡麗霞，印方平，季昱，周陽元，沈丹玉

1(杭州市富陽區食品安全檢驗檢測中心，浙江 杭州，311400)2(中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州，311400)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)是蕓香科花椒屬植物，原產于中國，廣泛分布于亞洲、美洲、非洲以及大洋洲的熱帶和亞熱帶地區。花椒是傳統的香辛料，其果皮被譽為“中國八大調味品之一”。花椒具有藥用價值，不僅有溫中、行氣、逐寒、止痛、殺蟲等多種功效，還可醫治嘔吐、胃痛、腹瀉等病癥，并可以作為表皮麻醉鎮定劑[1]。花椒在我國云南、貴州、四川、重慶等地均有廣泛栽植，是云貴川山區農民脫貧致富的重要經濟作物[2]。

花椒為多年生灌木，除了有危害根部、葉部和樹干等多種病害外，還容易發生銅色跳甲、藍桔跳甲、紅蜘蛛、蚜蟲、小吉丁蟲、大衰蛾、木撩尺蠖等多種蟲害，因此農藥的使用不可避免[3]。花椒一年之中打十一、二次農藥。催芽、催枝、保花、保果、打蚜蟲、治蜘蛛都要打農藥，而且打農藥經常要重復打2次或3次才能起效果。農藥測定是花椒質量安全的重要保證。

測量不確定度是指由于測量誤差的存在，對被測量值不能確定的程度[4-5]。測量不確定度直接影響測量結果的判定[6]，是檢測數據可靠性的重要保證[7]。目前關于菊酯類農藥的檢測方法很多，對氣相色譜法測定氯菊酯和氣相色譜-串聯質譜法(gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS)測定其他種菊酯類農藥的不確定度評定也有較多報道[3,8-10]，而關于GB 23200.113—2018《食品安全國家標準 植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯用法》測定氯菊酯的不確定度評定還未見相關報道。本文根據《測量不確定度標示指南》和JJF 1059.1—2012技術規程[11]要求，對GC-MS/MS法測量花椒中氯菊酯結果的不確定度進行評定,分析不確定度來源,確定影響結果的主要因素，提高測定結果的準確度。

1 材料與方法

7000B氣相色譜-串聯質譜，美國Agilent公司；T10均質機，德國IKA公司；RV10旋轉蒸發儀，德國IKA公司；HSC-24氮吹儀，天津市恒奧科技發展有限公司；氯菊酯標準溶液(GSB05-2309-2016，100 μg/mL，不確定度0.11 μg/mL)，農業部環境保護科研監測所；環氧七氯標準品(C 14101000，10 mg，99.36%，不確定度0.3%)，農業部環境保護科研監測所；正己烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯(色譜純)，美國FISHER公司；氯化鈉(優級純)，國藥集團化學試劑有限公司；花椒，當地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確移取1.0 mL氯菊酯標準母液，用正己烷定容得到10 μg/mL氯菊酯標準儲備液。儲備液用乙酸乙酯稀釋成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL系列標準工作液。

內標溶液：準確稱取10.0 mg(精確至0.1 mg)環氧七氯標準品，用乙酸乙酯溶解定容為1 mg/mL內標儲備液，再進一步用乙酸乙酯稀釋為5 mg/L的內標溶液。

1.2.2 樣品前處理

根據國標GB 23200.113—2018《食品安全國家標準 植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯用法》要求，準確稱取5.00 g(精確至0.01 g)粉碎好的花椒樣品，置于100 mL塑料離心管中，加10 mL超純水渦旋混勻，靜置30 min。再加20 mL乙腈，以15 000 r/min高速均質2 min。加5 g氯化鈉劇烈振蕩10 s，在4 ℃下以4 200 r/min離心5 min。準確吸取5 mL上清液，40 ℃水浴旋轉蒸發近干，待凈化。

用5 mL乙腈-甲苯溶液(體積比3∶1)預淋洗活化洗石墨化碳黑-氨基柱，棄去淋洗液。用5 mL乙腈-甲苯溶液溶解旋蒸瓶中待測物，過柱。重復2次，再用5 mL乙腈-甲苯溶液淋洗小柱，收集所有淋洗液，40 ℃水浴旋轉蒸發近干，用2.5 mL乙酸乙酯復溶，加50 μL環氧七氯內標溶液渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，用于GC-MS/MS測定。以離子對進行定性，內標法定量。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：HP-5MS柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；升溫程序為初始60 ℃保持1 min，先以40 ℃/min速率升至120 ℃，再以5 ℃/min速率升至240 ℃，最后以12 ℃/min 速率升至300 ℃保持6 min；流速1.2 mL/min；進樣口溫度280 ℃；接口溫度280 ℃；進樣量1 μL；進樣方式為不分流進樣；載氣為高純氦氣，純度≥99.999%；四極桿溫度150 ℃；離子源(EI)溫度 230 ℃；電離能量70 eV；檢測方式，多反應監測模式，氯菊酯的定量離子對183.1>153.0m/z，定性離子對183.1>168.0，碰撞能量分別為15、10 eV；環氧七氯的定量離子對353>262.8m/z，定性離子對353>218.9m/z，碰撞能量分別為15、35 eV。

1.2.4 數學模型的建立

按照標準方法，試樣中氯菊酯含量的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：X，花椒樣品中氯菊酯的含量，mg/kg；Cs，標準工作溶液中氯菊酯質量濃度，μg/mL；A，試樣溶液中氯菊酯的色譜峰面積；Ci，試樣溶液中環氧七氯的濃度，μg/mL；Asi，標準工作液中環氧七氯的色譜峰面積；As，基質標準工作溶液中氯菊酯的色譜峰面積；Csi，標準工作溶液中環氧七氯的質量濃度，μg/mL；Ai，標準工作溶液中環氧七氯的色譜峰面積；V，試樣上機液的最終定容體積，mL；m，花椒的質量，g。

1.2.5 不確定來源的分析

根據測定步驟和數學模型，GC-MS/MS法測定花椒中氯菊酯的不確定度來源包括：氯菊酯標準溶液和內標環氧七氯溶液的配制、標準曲線擬合引入的不確定度(B類評定)；花椒樣品重復測定引入的不確定度(A類評定)；花椒稱量過程引入的不確定度(B類評定)；提取、凈化和定容等前處理過程引入的不確定度(B類評定)；分析儀器GC-MS/MS引入的不確定度(B類評定)。

2 結果與分析

2.1 標準儲備液配制引入的不確定度

2.1.1 標準物質引入的不確定度

2.1.2 標準溶液配制過程引入的不確定度

由1 mL單線刻度移液管和10 mL A級容量瓶引入的相對標準不確定度分別如公式(2)～公式(4)所示：

=0.003 71

(2)

0.002 50

(3)

由氯菊酯標準儲備液配制所產生的相對不確定度為

(4)

2.1.3 內標物質引入的不確定度

由于在本次花椒測定氯菊酯過程中標準工作液和樣品待測液均加入同體積的同一份配制好的環氧七氯內標溶液，環氧七氯的純度和配制不影響花椒樣品中氯菊酯的含量測定，因此內標物質環氧七氯引入的不確定度只由其移取體積所產生。

2.2 標準工作液配制引入的不確定度

分別吸取0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL標準儲備液于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL這6個不同質量濃度點的標準工作液。再用100 μL移液槍移取50 μL環氧七氯溶液，分別與1 mL不同濃度標準工作液混合于1.5 mL進樣瓶中，得到與待測樣液相同環氧七氯內標含量的標準工作溶液。此過程產生的不確定度主要由玻璃量器、移液槍和室溫變化所引入。玻璃量器和移液槍的最大允許誤差按照檢定規程[13]規定。前處理室溫度設置為20 ℃，實際在±3 ℃范圍內波動。標準工作液用乙酸乙酯進行定容，當室溫為20 ℃時，其膨脹系數為1.38×10-3/℃。計算相對標準不確定度，具體結果見表1。

表1 標準溶液配制過程中移液管、移液槍的不確定度Table 1 Uncertainty of pipette and adjustable pipette in preparation of standard solution

由標準工作液配制引入的相對不確定度如公式(5)所示：

(5)

2.3 校正標準曲線引入的不確定度

配制好的相同環氧七氯含量的6點不同氯菊酯濃度系列標準工作液分別進行3次重復測定。以氯菊酯與環氧七氯的濃度比值作為橫坐標x，氯菊酯與環氧七氯的峰面積比值作為縱坐標y，進行線性擬合，得到標準曲線方程y=0.092 112x+0.003 107，R2=0.995 21。標準曲線引入的標準不確定度如公式(6)所示:

(6)

對花椒陰性樣品添加氯菊酯，添加水平為0.3 mg/kg，進行6次平行測定，使用前面擬合的標準曲線線性回歸方程為定量標準，計算氯菊酯的算術平均值和標準偏差，計算加標花椒重復測定引入的相對不確定度，花椒加標測量結果見表2。

表2 花椒樣品添加氯菊酯重復測量結果Table 2 The determination result of permethrin in pepper

2.4 樣品前處理引入的不確定度

2.4.1 樣品稱量引入的不確定度

2.4.2 樣品提取、凈化、定容引入的不確定度

花椒在提取、凈化、定容過程引入的不確定度主要是玻璃容量器具和室溫變化。前處理室溫度設為20 ℃，實際在±3 ℃范圍內波動。乙腈和乙酸乙酯在20 ℃時的膨脹系數分別為1.37×10-3/℃和1.38×10-3/℃。本次提取、凈化、定容所用到玻璃量具的相對標準不確定度結果見表3。

表3 前處理過程中移液管、移液槍的不確定度Table 3 Uncertainty of pipette and adjustable pipette in pretreatment

花椒提取、凈化、定容引入的相對不確定度如公式(7)所示：

(7)

2.4.3 重復測量不確定度

由表2得花椒添加0.3 mg/kg重復測量6次的平均回收率為95.7%，其標準偏差S(X)計算如公式(8)所示：

(8)

因此，前處理過程引入的不確定度如公式(9)所示:

(9)

2.5 分析儀器引入的不確定度

2.6 合成不確定度

由上述各相對標準不確定度分量合成花椒中添加氯菊酯相對標準不確定度如公式(10)所示：

urel(Z)

(10)

2.7 擴展不確定度

依據國家計量技術規范JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[14]的要求，正態分布在95.45%置信區間時包含因子k=2。花椒中添加0.3 mg/kg 氯菊酯的測量值為0.287 mg/kg，則花椒中氯菊酯含量測定的相對擴展不確定度為Urel=k×urel(Z)=2×0.063 49=0.127，擴展不確定度為U=Urel×W=0.127×0.287= 0.036 4 mg/kg。

2.8 測量不確定度報告

花椒中添加0.3 mg/kg氯菊酯測量結果表示為：(0.287±0.036 4) mg/kg，k=2。其相對標準不確定度統計見表4。

表4 相對標準不確定度統計結果Table 4 The statistics of the relative standard uncertainty

3 結論

采用GB 23200.113—2018《食品安全國家標準 植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯用法》中GC-MS/MS法測定花椒中添加0.3 mg/kg氯菊酯的結果平均值為0.287 mg/kg，擴展不確定度為0.036 4 mg/kg (k=2)，測量結果表示為(0.287±0.036 4) mg/kg。由表4可知，本方法不確定度來源中標準曲線擬合引入的不確定度為最大影響因素，其次是標準工作液配制過程和分析儀器引入的不確定度。樣品前處理對不確定度也有一定貢獻，氯菊酯標準儲備液配制的影響最小。依據本研究結果，建議在GC-MS/MS檢測菊酯類農藥過程中選用精度較好的量器，規范移液管和容量瓶的操作，確保標準工作溶液濃度的準確性；選擇擬合線性高的工作曲線進行校準；對分析儀器進行日常維護和按時檢定；適當增加平行樣，規范前處理步驟，進一步提高檢測結果的準確度。