microRNA調控動物皮下脂肪組織和肌內脂肪沉積的研究進展

岳永起，華永琳，熊 燕1,2,*，林亞秋，熊顯榮1,2,，李 鍵1,2,*

(1. 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041； 2. 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041； 3. 西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041)

在動物生產中，不同部位脂肪組織沉積直接影響動物的產肉性能、肌肉品質和營養價值。目前，我國的產肉量基本滿足國民生活需求，但是肉品質亟待提高，因此改善動物肉品質是動物遺傳育種研究領域的重點。近年來，研究者在脂肪細胞的分化調控等方面取得了較大的研究進展，發現了多個脂肪沉積的蛋白編碼基因，基本形成了脂肪細胞分化的蛋白調控分子網絡。而脂肪沉積是一個復雜的生理生化過程，還受到非編碼RNA在轉錄、轉錄后及翻譯水平的調控作用。其中，miRNA由于具有高度的組織特異性，靶向脂肪沉積相關的關鍵調控因子調控脂肪沉積。miRNA對脂肪沉積的調控引起了研究者的廣泛關注，并且在最新的研究中取得了較大的突破。因此，本文對最新研究成果進行綜述，為miRNA在不同部位脂肪組織的差異沉積提供新的思路和方向。

1 脂肪組織的分類

1.1 不同類型的脂肪組織

當人們談論脂肪時，通常是指脂肪的兩個經典類型，即白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)。白色脂肪組織主要位于皮下及內臟器官周圍，為動物機體提供隔熱和保護的作用。主要功能是以甘油三酯的形式儲存過剩的能量[1]。在機體需要時，這些能量將會釋放出來。棕色脂肪組織內含許多散在的小脂滴和線粒體，將儲存的能量以產熱的形式消耗[2]，這一過程主要通過位于棕色脂肪細胞線粒體內膜上的解偶聯蛋白-1(uncoupling protein 1, UCP-1)發揮作用[3]。最近人們的研究發現，還存在其他的脂肪組織，如米色脂肪(beige fat)、粉紅色脂肪(pink fat)和黃色脂肪(yellow fat)。米色脂肪是一種特殊的脂肪類型，在冷刺激下，白色脂肪組織會向米色脂肪組織轉化[4]。研究發現盡管米色脂肪組織存在于白色脂肪中，但功能與棕色脂肪相似[5]。棕色和米色脂肪細胞通過上調UCP-1促進產熱，維持動物機體溫度的恒定[4]。粉色脂肪組織在雌性動物妊娠和哺乳期內由白色脂肪組織轉化而來，由乳腺上皮細胞組成，主要參與乳汁的分泌[6]。黃色脂肪組織主要是骨髓脂肪細胞，形態與白色脂肪組織類似，但具有自己的特性。研究表明，黃色脂肪的成脂特異基因低表達，而與炎癥應答相關的基因高表達[7]，其在骨平衡及骨代謝方面起重要作用(圖1)。

圖1 脂肪組織的分類[6]Fig.1 Classification of adipose tissues[6]

A. 皮下脂肪的分布;B. 肌內脂肪A.Distribution of subcutaneous fat; B. Intramuscular fat圖2 小鼠脂肪組織解剖學位置[12-13]Fig.2 Anatomical locations of adipose tissues in mice[12-13]

1.2 不同部位的脂肪組織

根據脂肪組織解剖學部位的不同也可以將脂肪組織分為皮下脂肪、肌內脂肪和包裹腹腔臟器的內臟脂肪。皮下脂肪約占動物總脂肪含量的70%左右，主要貯存于皮下，如腹股溝白色脂肪、腹部白色脂肪等，主要執行隔熱、保護[8]和儲存的功能(圖2A)。肌內脂肪組織位于肌肉纖維束內，均勻分布于肌肉組織中，與肌肉中的膜蛋白結合緊密。主要由肌內脂肪細胞組成，來源于間充質干細胞[9]。其含量與動物肉產品的品質密切相關，直接影響肉的多汁性、嫩度和風味(圖2B)[10]。研究表明，皮下脂肪含量與肌內脂肪含量為中度相關，之前的研究發現，不同部位脂肪分化的分子調控和代謝存在差異，如miR-130a可以靶向PPARγ，但miR-130a在肌內脂肪的表達量顯著高于皮下脂肪[11]。這種差異為探尋提高肌內脂肪的同時不影響皮下脂肪的沉積提供可能性。因此，篩選得到在皮下脂肪和肌內脂肪之間具有差異的miRNAs對研究不同部位脂肪沉積具有重要意義。

2 不同脂肪細胞的來源及分化

不同類型脂肪細胞來源不同，最初的研究表明，白色脂肪細胞和棕色脂肪細胞主要是由脂肪組織中的間充質祖細胞分化而來。其中Myf5+細胞在不同的轉錄因子作用下可分化為棕色脂肪細胞和肌細胞，白色脂肪細胞主要是由Myf5—細胞分化而來[14]。也有研究表明，白色脂肪細胞也可由Myf5+細胞分化而來[15]。近年來，有研究報道，通過同源轉錄因子En1標記中胚層的祖細胞及分化產物，發現棕色脂肪細胞和骨骼肌都起源于中胚層細胞[16]。這些細胞表達成肌標志基因生肌因子5(myofactor-5,Myf5)和配對框7(paired box 7，Pax7)[17]，這與棕色脂肪細胞和肌細胞具有相同來源的觀點一致。而通過建立WTI為啟動子的小鼠，發現小鼠的內臟脂肪組織中的脂肪細胞大部分起源于胚胎期側中胚層間皮細胞[18]。運用譜系追蹤法，發現具有間充質特性的前脂肪細胞因子1(Pref-1)陽性細胞是分化早期的脂肪祖細胞，為皮下脂肪細胞的起源之一[14]。以上表明，脂肪細胞都起源于中胚層，但脂肪細胞的祖先并不單一，說明脂肪細胞有多種起源，在發育過程中各自發揮作用(圖3)。

圖3 脂肪細胞的來源及分化Fig.3 The source and differentiation of adipocytes

目前有關米色脂肪細胞的起源及遺傳特性研究較少，米色脂肪存在于白色脂肪中，但功能與棕色脂肪細胞相似。目前研究報道表明，在冷刺激、激動劑等作用下，成熟的白色脂肪細胞可轉化為米色脂肪細胞。也有報道認為，在iWAT中大部分的米色脂肪細胞具有特有的祖細胞，不是由WAT轉化而來。研究發現，血清白細胞分化抗原137(Cd137)與跨膜蛋白26(TMEM26)是白色脂肪組織中米色脂肪祖細胞的標志基因[19]。表明米色脂肪細胞主要有兩種來源：1)由成熟的白色脂肪細胞轉化而來；2)由米色脂肪細胞祖細胞分化而來(圖3)。

目前為止，有關于肌內脂肪細胞的起源尚不完全清楚。有研究報道，肌內脂肪細胞可以由體外肌衛星細胞分化而來[20]。Uezumi等[21]通過流式細胞分選技術，發現從骨骼肌分離出的PDGFRα+間質祖細胞也是肌內脂肪細胞的主要來源。以MyoD-Cre[22]、Myf5-Cre[23]和Pax3-Cre[24]介導的追蹤小鼠模型發現，非肌源性祖細胞也可分化為肌內脂肪細胞。以上研究表明，肌內脂肪細胞可由間質干細胞或者其他類型干細胞分化而來。

3 miRNA對動物皮下脂肪沉積的影響

3.1 與皮下脂肪沉積相關miRNA的篩選

隨著組學技術的快速發展，研究者發現并鑒定了與動物皮下脂肪沉積相關的miRNAs表達譜。在豬中，篩選了藍塘豬和長白豬皮下脂肪組織差異表達的miRNA。在藍塘豬中顯著上調的miRNA有25個，包括 miR-183、miR-125b等；下調的有23個， 包括miR-221、miR-107等[25]。Xu等[26]通過RNA-seq獲得了嘉興黑豬皮下和肌內脂肪細胞的miRNA表達譜，鑒定出741個miRNAs，包括155個顯著差異表達(SDE)miRNAs。其中miR-206過表達抑制細胞增殖和甘油三酯的積累。隨著分子技術的發展，研究者通過下一代測序(NGS)方法，比較了3種(大白豬、皮特蘭豬和漢普夏豬)不同脂肪特征豬種之間的miRNAome圖譜，鑒定了差異表達的miRNA：大白豬46個，皮特蘭豬61個，漢普夏豬41個， 共同存在于3個品種的有14個miRNAs[27]。

在反芻動物中，研究者通過基因芯片研究了成年肉牛肌內脂肪和皮下脂肪中差異表達的miRNA。發現miR-26a、miR-2373-5p、miR-2325c、miR-3613和miR-2361在皮下脂肪豐度最高[28]。基于EST(表達序列標簽)和GSS(基因組概覽序列)分析，Liang 等[29]在脂肪組織檢測到20個保守miRNAs，其中miR-143、miR-145、miR-2325c和miR-2361可能調節脂肪沉積。此外，研究者鑒定出脂肪尾和細尾綿羊脂肪組織中共同表達的miRNA有539個，脂肪特異性表達miRNA分別有179和97個，發現了35個新的miRNAs，通路富集分析發現其主要通過脂質代謝影響脂肪的沉積[30]。

在家禽中，研究人員構建了雞腹部脂肪組織的小RNA文庫，鑒定出507個已知的miRNAs和53個新的miRNAs。發現miR-30、miR-34、miR-199、miR-8和miR-146等可能在脂質代謝、脂肪細胞增殖和分化等方面發揮關鍵作用[31]。以上研究通過組學技術探究miRNA在不同動物脂肪組織模型中的差異表達模式，同時發現miRNA在物種和組織中存在特異性，并且挖掘了很多新的miRNAs。近年來，研究人員重點研究了特定miRNA對不同部位或不同類型脂肪細胞分化及脂肪沉積的功能作用的分子機制，為完善脂肪組織的miRNA調控網絡提供了理論數據，同時對改善肉產品質量和肥胖相關疾病的治療提供了分子靶點。

3.2 miRNA負向調控動物皮下脂肪沉積

降低動物皮下脂肪的沉積對動物的產肉性能具有重要意義。有報道稱，皮下脂肪組織的減少由以下兩個因素決定：一是抑制脂肪細胞增殖和分化；二是抑制脂質積累和促進脂解。研究人員通過測序發掘了許多調控脂肪沉積的miRNAs，并對這些差異miRNAs在皮下脂肪沉積中的功能進行研究。其中，miR-378[32-33]、miR-155[34-35]、miR-204-5p[36]、bta-miR-130a/b和miR-27[37-38]家族等主要是通過抑制脂肪合成相關基因和促進脂解相關基因的表達來調控脂肪的沉積。miR-27通過PPARγ和脂肪酸結合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)作用，抑制脂肪沉積[39]。過表達bta-miR-130a/b導致在脂肪生成過程中細胞甘油三酯(TG)水平顯著下降，并通過靶向PPARγ減少脂滴形成[40]。而miR-27a[41]、miR-340-5p[42]、miR-145[43]miR-127[44]、bta-miR-150[45]、miR-99b-5p和miR-212[46]等主要是通過抑制脂肪細胞增殖和分化來調控脂肪沉積。如bta-miR-150過表達可以提高增殖相關基因周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)和增殖細胞核抗原(PCNA)的mRNA和蛋白質水平，進而促進脂肪細胞增殖，抑制脂肪細胞分化，減少脂滴的形成調控脂肪沉積[45]。過表達miR-99b-5p可以促進細胞周期，抑制脂肪細胞分化。結合蛋白質組學測序發現，miR-99b-5p可以直接與SCD1和Lpin1蛋白作用進而發揮功能[47]。上述研究表明，miRNA通過靶向細胞周期相關調控因子、成脂及脂質代謝相關基因，進而調控脂肪細胞的增殖、分化和能量消耗，最終影響動物脂肪沉積(圖4)。

圖4 調控脂肪沉積的miRNAFig.4 miRNA regulating fat deposition

3.3 miRNA正向調控動物皮下脂肪的沉積

研究發現，miR-143、miR-103和miR-15a/b等正向調控皮下脂肪的沉積。miR-143是發現最早的正向調控脂肪細胞分化的miRNA，Esau等[48-49]研究表明，miR-143通過靶向促分裂原活化蛋白激酶5(mitogen-activated protein kinase 5,MAPK5)、促分裂原活化蛋白激酶7(mitogen-activated protein kinase 7,MAPK7)和抑制多效生長因子(Pleiotrophin，PTN)促進脂肪細胞的分化。另一方面，miR-143通過靶向Smad家族成員3(Smad family member 3,Smad3)促進脂質合成相關基因的表達[50]。上述研究說明，miR-143是脂肪沉積重要的正向調節因子。在豬中研究報道，過表達miR-103通過上調成脂標志基因PPARγ和泛素關聯蛋白2(ubiquitin associated protein 2，UBAP2)，促進豬原代脂肪細胞的成脂分化[51]。miR-106a通過細胞周期負調控因子p21、成骨蛋白和促激蛋白膜結合抑制因子(BMP and activin membrane-bound inhibitor，BAMBI)促進豬前脂肪細胞的增殖和分化。miR-15a/b、miR-183和miR-125b-5p通過靶向Smad家族成員4(Smad family member 4，Smad4)和叉頭框O1(forkhead box O1A，FoxO1)促進前體脂肪細胞分化[52-53]。在牛中有報道表明，miR-142-5P和miR-1271等在調節牛脂肪沉積中具有重要作用。Sui等[54]研究表明，miR-142-5P促進脂肪脂質代謝，主要是通過連環蛋白(鈣粘著蛋白關聯蛋白)β1(CTNNB1)來發揮作用。miR-1271激活轉錄因子3(ATF3)促進甘油三酯的積累，與調控轉錄因子PPARγ和C/EBPα結合促進黃牛前體脂肪細胞的分化[55]。此外，miR-220a通過抑制非經典的Wnt信號來增加脂肪細胞特異性基因的表達，促進牛脂肪細胞的分化[56]。除了上述促進脂肪沉積的miRNAs外，還有miR-22[57]、miR-425-5p[58]、miR-429[59]、miR-125a[60]、miR-324-5p[61]等也參與脂肪沉積的正向調控。上述結果說明，miRNA主要通過靶向促進脂肪細胞分化和脂質合成的相關基因來正向調控動物體脂肪沉積。

4 miRNA對肌內脂肪組織脂肪沉積的影響

4.1 與肌內脂肪差異沉積有關的miRNA篩選

動物脂肪沉積實質上是脂肪細胞數量的增多和體積的增大。而肌內脂肪的沉積相較于其他部位是較為困難的，肌內脂肪沉積是影響動物肉產品品質的關鍵因素。因此，從分子水平研究肌內脂肪沉積調控機制具有重要意義。研究者通過構建玫瑰冠雞和科寶雞兩種雞腿肌的小RNA文庫，分析獲得了表達差異顯著的miRNA，其中公雞腿肌對比庫中差異表達顯著的miRNA 有306個(上調154個，下調152個)，母雞腿肌對比庫中差異表達顯著的miRNA 有335個(上調171個，下調164個)[62]。Huang等[63]通過小RNA測序鑒定出了108個在水牛中差異表達的miRNAs，其中有98個已知的miRNAs和10個新的miRNAs，q-PCR驗證結果顯示，bta-miR-148a、bta-miR-143、bta-miR-10b、bta-let-7i、bta-let-7f、bta-let-7b、bta-miR-30a-5p和bta-miR-100在肌內脂肪組織中高表達。Li等[64]通過RNA測序對兩頭背最長肌肌內脂肪含量差異較大的新疆棕牛進行miRNA-mRNA相互作用網絡構建，發現362個miRNAs表達差異顯著，其中252個顯著上調，110個顯著下調。Sun等[65]對豬背最長肌肌內脂肪進行miRNA深度測序，結果表明，鑒定出268個miRNAs，其中已知miRNA 70個，在豬中保守的miRNA 162個，特異性miRNA 36個。檢測金華豬和長白豬肌內脂肪miRNA的表達譜，發現了287個已知miRNAs和271個新miRNAs，其中220個 miRNAs在豬中差異表達，功能預測顯示，這些miRNAs主要通過參與脂肪代謝來調控肌內脂肪組織的沉積[66]。鑒于肌肉組織中的主要細胞類型為多核肌管及骨骼肌衛星細胞，肌內脂肪細胞數量較少，因此以肌內脂肪沉積具有差異的肌肉組織篩選參與肌內脂肪沉積的miRNA存在一定的局限性。

4.2 以體外肌內脂肪細胞模型篩選調控肌內脂肪沉積的miRNA

隨著試驗技術的發展，近年來，研究者基于體外肌內脂肪細胞模型篩選差異表達的miRNA，發掘對肌內脂肪沉積具有重要作用的miRNA。研究者從脂肪組織中分離牛肌內前體脂肪細胞，誘導分化為成熟的脂肪細胞，對其進行RNA測序，發現差異表達的miRNA有119個；qPCR結果表明，miR-149-5p、miR-24-3p、miR-199a-5p、miR-33a等表達模式與測序結果一致；通路富集結果顯示，差異表達的miRNAs主要參與脂質代謝[67]。通過Solexa深度測序方法對分化過程中的原代肌內和皮下脂肪細胞進行測序，發現了224個已知的miRNAs和280個潛在的miRNAs，其中特異性表達的miRNA 有30個(肌內脂肪細胞中24個，皮下脂肪細胞中6個)， 同時發現，這些miRNA主要通過靶向脂肪生成基因來發揮功能[68]。

4.3 miRNA調控動物肌內脂肪的沉積

肌內脂肪含量與動物肉產品的感官品質和食用品質密切相關，直接影響著肉的風味、多汁性、嫩度、色澤。當下改善動物肉產品品質的主要難點集中于如何在保證瘦肉率的前提下，降低皮下脂肪的含量。通過對前人的研究結果進行總結，發現了一系列調控肌內脂肪沉積的miRNAs。例如，在雞中，有研究發現gga-miR-140-5p[69]、miR-223[70]、miR-451[71]、miR-15a[72]和miR-155-5p[73]等在雞肌內脂肪沉積過程中發揮重要作用。其中，幼雞和具有肌內脂肪含量較高的成年雞相比，差異表達的miRNA更多。gga-miR-140-5p可通過靶向類維生素a X受體γ(RARγ)促進肌內前體脂肪細胞分化。而乙酰輔酶A羧化酶α(ACACA)作為脂肪酸合成調控的關鍵因子，受到miR-451和miR-15a的調控，進而影響脂肪沉積。

在反芻動物中，miR-381和miR-17-3p是調控延邊黃牛肌內脂肪沉積的重要miRNA，miR-381和miR-17-3p通過靶向抑制含鉀離子通道四聚化結構域15(KCTD15)的表達，促進脂肪細胞的分化[74-75]。有研究表明，PPARγ是脂肪組織形成過程中重要的轉錄因子，miR-210[76]、miR-130a/b[40]、miR-540、miR-548 d-5p和miR-301a[77-78](表1)均可直接或間接靶向PPARγ來調控肌內脂肪細胞的分化。如miR-210通過靶向Wnt1可誘導信號通路蛋白2(WISP2)正向調控胎牛肌內脂肪細胞脂肪的形成[79]。WISP2與PPARγ轉錄激活因子鋅指蛋白423(Zfp423)形成胞質復合物，而骨形態發生蛋白4(BMP4)以SMAD依賴的方式解離該復合物，最終導致PPARγ的激活[76]。miR-26b-5p、miR-106b-5p[80]和 miR-25-3p[81]等(表1)對羊肌內脂肪細胞分化具有重要作用，其中 miR-26b-5p通過靶向成纖維樣因子21(FGF21)促進脂肪生成標志基因和脂質合成相關基因的表達，調控山羊肌內脂肪細胞的分化[82]。

表1 參與動物肌內脂肪沉積的miRNAs

在體外分離的肌內脂肪細胞中，差異表達的gga-miR-18b-3p通過靶向重組人酰基輔酶A硫酯酶13(Acyl-coenzyme A thioesterase 13，ACOT13)的3′UTR進而抑制肌內脂肪細胞的分化[83]。miR-17-5p的靶基因是核受體輔激活蛋白3(nuclear receptor coactivator 3，NCOA3)，過表達miR-17-5p可抑制NCOA3的表達進而抑制前脂肪細胞分化，FABP4和PPARγ表達也明顯降低，甘油三酯含量也降低。同時，敲低miR-17-5p可以顯著增加NCOA3的表達，促進肌內脂肪細胞的分化[84]。此外，miR-125a-5p[85]、miR-124-3p[86-87]和miR-548d-5p[88]等也參與肌內脂肪沉積的調控(表1)。

5 展 望

隨著人們生活水平提高, 消費者對肉品質提出了更高的要求，因此改善畜禽肉品質是動物遺傳育種的熱點關注問題。但是重點和難點在于降低皮下脂肪的含量的同時，適當提高肌內脂肪的沉積。近年來，科研人員發現miRNA對畜禽脂肪沉積調控具有重要作用, 而miRNA對于脂肪沉積的作用機制與網絡還不完善。通過鑒定篩選與脂肪沉積調控相關的關鍵miRNA, 進一步完善miRNA調控脂肪沉積的作用網絡和分子機制, 將為畜禽肉品質的遺傳改良和肥胖相關疾病的治療提供新的靶點和策略。