LED脈沖光對生菜葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

梅延豪 劉 齊 李 琦 虞慧彬 白雅暉 徐曉東 武永軍 楊振超*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

葉綠素?zé)晒馀c植物光合作用的關(guān)系十分密切，常常被用作快速檢驗(yàn)植物光合作用的探針。使用各種熒光參數(shù)可反映光合作用中光合反應(yīng)中心各個(gè)電子傳遞體的活躍狀態(tài)、電子傳遞速率、CO2同化速率及能量分配的情況[1-5]。

發(fā)光二極管(Light-emitting diode，LED)在植物工廠和溫室等可控環(huán)境下的作物補(bǔ)光領(lǐng)域得到了飛速的發(fā)展，很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)光源在設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的不足。然而，作物補(bǔ)光所造成的成本輸出仍占很大比重，繼續(xù)研發(fā)高效節(jié)能的植物補(bǔ)光燈勢在必行[6-7]。

LED的特性之一是可以發(fā)射間歇性的脈沖光，它由脈沖寬度調(diào)制(PWM)方法產(chǎn)生，在照明系統(tǒng)中提供各種頻率和占空比(光亮?xí)r間占整個(gè)光-暗周期的比值)[8]。相比連續(xù)光，脈沖光似乎更有利于植物光合效率的提高。實(shí)際上，植物下半部分葉片接收到的光是透過上層葉片擺動(dòng)產(chǎn)生的間歇性太陽光，而非連續(xù)的，且這些葉片在非連續(xù)光下生長依然良好[9]。波動(dòng)的光環(huán)境與光合作用動(dòng)力學(xué)之間的關(guān)系比較復(fù)雜，這對于研究生態(tài)系統(tǒng)中的植物及其性能至關(guān)重要[10]。Tennessen等[11]研究表明，番茄植株對脈沖LED的光合響應(yīng)優(yōu)于對連續(xù)光照的響應(yīng)。Son等[12]研究表明占空比為75%，1、10和30 kHz 頻率下的脈沖光對生菜生長的影響，相比連續(xù)光，生菜葉片的光合速率沒有顯著性差異；除了30 kHz的脈沖光外，其他組合的脈沖光都提高了光能利用率，并且頻率越高，光能利用率越低。王曉旭等[13]在研究不同脈沖光處理生菜時(shí)發(fā)現(xiàn)，各處理間生菜的形態(tài)、品質(zhì)和凈光合速率都有差異，低頻率和低占空比的脈沖光雖然耗電量低，但不利于葉綠素的合成和光合作用。牟孫濤等[14]發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)光強(qiáng)一定時(shí)，隨著頻率和占空比的增加，凈光合速率也在增加，且在一定頻率和占空比組合的脈沖光下的凈光合速率與連續(xù)光無顯著差異。這說明脈沖光的研究有望在不抑制植物生長的情況下降低LED能耗，節(jié)約能源[15]。然而，植物在某些特定脈沖光照射下能達(dá)到與連續(xù)光基本相同的凈光合速率至今未探索出其機(jī)理性原因。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究利用熒光儀測定了生菜葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，旨在探究脈沖光對生菜葉綠素?zé)晒獾挠绊懀云跒檠邪l(fā)適宜生菜正常生長的高效節(jié)能補(bǔ)光燈提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2019年10月—2020年8月在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施農(nóng)業(yè)生物與環(huán)境工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試材料為玻璃生菜(LactucasativaL.)，種子由青縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心提供。光源采用西安因變光電科技有限公司生產(chǎn)的LED燈板和LED控制系統(tǒng)V1.0，可調(diào)節(jié)LED的光照強(qiáng)度、頻率和占空比。LED燈板尺寸為35 cm×35 cm，距培養(yǎng)架底部的起始距離為43 cm。

將催芽后的生菜種子播種于72孔的穴盤中，置于人工氣候箱進(jìn)行常規(guī)管理。氣候箱光/暗時(shí)間分別設(shè)為14 h和10 h，光期溫度為22 ℃，空氣相對濕度為65%；暗期溫度為20 ℃，空氣相對濕度為60%。播種25天后，選取4葉1心且長勢整齊的幼苗定植于7 cm×7 cm×7 cm的營養(yǎng)缽中，然后轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室內(nèi)LED燈板下分別進(jìn)行處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置14個(gè)頻率水平(1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 048、4 096和8 192 Hz)和5個(gè)占空比水平(20%、40%、60%、80%和100%)，共計(jì)70個(gè)組合，其中100%占空比為連續(xù)光對照。脈沖光和連續(xù)光的瞬時(shí)光強(qiáng)均設(shè)為200 μmol/(m2·s)，光周期為14 h/10 h。定植后的生菜分別在設(shè)定不同頻率和占空比的LED燈板下處理10 d，第11天測定各處理的葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)，試驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.3 項(xiàng)目測定

利用雙通道調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xDUAL-PAM-100(WALZ，德國)測定。處理第11天時(shí)，每個(gè)處理隨機(jī)選5株生菜，選取生長點(diǎn)下第5片功能葉測定。測量前，利用DLC-8葉夾先將需測定的生菜葉片暗適應(yīng)30 min，然后打開測量光，記錄暗適應(yīng)后的最小熒光Fo；緊接著打開1個(gè)持續(xù)時(shí)間0.3 s的飽和脈沖光，測量并記錄暗適應(yīng)后的最大熒光Fm；飽和脈沖光關(guān)閉后熒光迅速回到Fo附近，然后打開光化光，記錄葉綠素?zé)晒鈴暮诎缔D(zhuǎn)到光照的響應(yīng)過程，待熒光曲線達(dá)到穩(wěn)態(tài)后關(guān)閉光化光，結(jié)束整個(gè)測量過程，記錄并保存熒光數(shù)據(jù)。葉綠素?zé)晒獾幕緟?shù)包括：暗適應(yīng)下的初始熒光Fo和最大熒光Fm；光適應(yīng)下的最小熒光Fo′、穩(wěn)態(tài)熒光Fs和最大熒光Fm′。其他具體熒光參數(shù)名稱及公式如表1[16]。

表1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)及計(jì)算公式Table 1 Chlorophyll fluorescence parameters and calculation formula

1.4 分析方法

采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 23.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，利用Duncan檢驗(yàn)處理間差異的顯著性水平(P<0.05)，采用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脈沖光處理對生菜葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和Fv/Fo分別反映了植物葉片PSII原初光能轉(zhuǎn)換效率和PSII潛在活性的大小[17]。由圖1(a)可看出，占空比為20%時(shí)，脈沖光頻率低于256 Hz的生菜葉片的Fv/Fm值顯著低于連續(xù)光處理；占空比為40%、頻率為4～64 Hz以及占空比為60%和80%、頻率為16 Hz時(shí)，脈沖光處理的生菜葉片F(xiàn)v/Fm值同樣顯著低于連續(xù)光處理。占空比為40%和60%、頻率為256～512 Hz以及占空比為80%、頻率為分別為64 和256 Hz時(shí)，脈沖光處理的生菜葉片的Fv/Fm值要顯著高于連續(xù)光處理，其他脈沖光處理Fv/Fm值均與連續(xù)光無顯著差異。由圖1(b)可看出，F(xiàn)v/Fo的分析結(jié)果與Fv/Fm相似，占空比為20%時(shí)，除了256 Hz以下的Fv/Fo值顯著低于連續(xù)光外，其余脈沖光處理均不低于連續(xù)光。以上結(jié)果表明，低頻率和低占空比的脈沖光處理會(huì)降低生菜葉片的Fv/Fm和Fv/Fo值，而高頻率或高占空比對生菜葉片的光合能力沒有顯著影響。

2.2 不同脈沖光處理對生菜葉片光下PSII光化學(xué)效率的影響

Fv′/Fm′反映的是PSII反應(yīng)中心完全開放時(shí)的最大光化學(xué)量子效率[18-19]。由圖2(a)可知，占空比為20%、40%、60%和80%時(shí)，頻率分別達(dá)到256、256、128和32 Hz及以上的Fv′/Fm′值與連續(xù)光無顯著差異。此外，占空比為40%～60%、頻率為1～2 Hz以及占空比為80%、頻率為1～4 Hz時(shí)，脈沖光處理的Fv′/Fm′值同樣與連續(xù)光Fv′/Fm′值無顯著差異。由圖2(b)可知，當(dāng)頻率高于128 Hz時(shí)，不同占空比對生菜葉片ΦPSII值均沒有顯著差異。脈沖光的頻率為128 Hz及以下時(shí)，當(dāng)占空比為60%，1～2 Hz的ΦPSII值與連續(xù)光無顯著差異；當(dāng)占空比為80%，除8～16 Hz外，其余ΦPSII值均與連續(xù)光無顯著差異。綜上，當(dāng)不同占空比脈沖光的頻率增長到一定數(shù)值時(shí)，其對生菜葉片的光化學(xué)量子效率沒有顯著影響，而低于這些頻率會(huì)對光化學(xué)量子效率造成影響，導(dǎo)致光合效率降低。

折線上的誤差線表示不同占空比處理間的差異顯著水平，P<0.05。下同。Error lines on the broken line indicate the significant level of difference among different duty ratio treatments, P<0.05. The same below.圖1 不同脈沖光處理對生菜葉片F(xiàn)v/Fm(a)和Fv/Fo(b)的影響Fig.1 Effects of different pulsed light treatments on Fv/Fm (a) and Fv/Fo (b) of lettuce leaves

圖2 不同脈沖光處理對生菜葉片F(xiàn)v′/Fm′(a)和ФPSII(b)的影響Fig.2 Effects of different pulsed light treatments on Fv′/Fm′ (a) and ФPSII (b) of lettuce leaves

2.3 不同脈沖光處理對生菜葉片熒光淬滅的影響

光化學(xué)淬滅qP反映了PSII反應(yīng)中心的開放程度和原初電子受體QA的還原狀態(tài)；非光化學(xué)淬滅NPQ反映的是PSII天線色素吸收的光能以熱的形式耗散掉的部分[20]。由圖3(a)可以看出，占空比為20%和40%時(shí)，頻率分別達(dá)到256 Hz和128 Hz及以上的qP值與連續(xù)光無顯著差異；除占空比為60%、頻率為4和16 Hz以及占空比為80%、頻率為16 Hz時(shí)，脈沖光處理的qP值顯著低于連續(xù)光外，其他處理均與連續(xù)光無顯著差異，說明絕大多數(shù)高占空比的脈沖光處理不會(huì)影響生菜葉片PSII反應(yīng)中心的活性。由圖3(b)可以看出，占空比為20%、40%和60%，頻率分別達(dá)到512、256和256 Hz及以上時(shí)，脈沖光處理的NPQ值與連續(xù)光處理無顯著差異；占空比為80%時(shí)，除16～64 Hz的NPQ值顯著高于連續(xù)光外，其余均與連續(xù)光無顯著性差異；而頻率為1 Hz時(shí)，40%～80%占空比脈沖光處理的NPQ值同樣與連續(xù)光無顯著性差異。以上結(jié)果說明，不同占空比的低頻率脈沖光處理會(huì)導(dǎo)致生菜葉片吸收的光能轉(zhuǎn)換為熱的部分增加，高頻率不會(huì)對此造成影響。另外，除了20%占空比的1 Hz脈沖光也不會(huì)導(dǎo)致熱耗散增加。

圖3 不同脈沖光處理對生菜葉片qP(a)和NPQ(b)的影響Fig.3 Effects of different pulsed light treatments on qP (a) and NPQ (b) of lettuce leaves

2.4 不同脈沖光對生菜葉片非光化學(xué)耗散量的影響

ΦNO代表的是被動(dòng)地耗散為熱量和發(fā)出熒光的能量，主要由關(guān)閉態(tài)的PSII反應(yīng)中心貢獻(xiàn)；ΦNPQ代表的是通過調(diào)節(jié)性的光保護(hù)機(jī)制耗散為熱的能量[18-20]。由圖4(a)可以看出，占空比20%～40%、頻率1～2 Hz 組合的ΦNO值顯著高于連續(xù)光及其他處理，分別比連續(xù)光高出了13.54%、12.23%、20.00%和5.78%，而其余脈沖光處理與連續(xù)光相比均無顯著差異，說明除了1～2 Hz的低占空比外，脈沖光不會(huì)導(dǎo)致生菜葉片的ΦNO升高或降低。由圖4(b)可知，頻率低于256 Hz時(shí)，20%占空比脈沖光處理的ΦNPQ值顯著高于連續(xù)光處理；占空比為40%～60%、頻率為2～128 Hz以及占空比為80%、頻率為8～128 Hz時(shí)，脈沖光處理的ΦNPQ值同樣顯著高于連續(xù)光處理。相反，頻率為256 Hz及以上時(shí)，脈沖光處理的ΦNPQ值與連續(xù)光無顯著差異。結(jié)果表明256 Hz及以上頻率不會(huì)對生菜葉片的ΦNPQ產(chǎn)生影響，256 Hz以下頻率的大部分脈沖光處理會(huì)導(dǎo)致PSII調(diào)節(jié)性熱耗散能量的增加。

圖4 不同脈沖光處理對生菜葉片ΦNO(a)和ΦNPQ(b)的影響Fig.4 Effects of different pulsed light treatments on ΦNO (a) and ΦNPQ (b) of lettuce leaves

3 討 論

3.1 脈沖光對PSII反應(yīng)中心活性的影響

目前利用葉綠素?zé)晒鉁y量來檢測植物的光合性能和脅迫作用，已廣泛應(yīng)用于植物生理和生態(tài)生理研究中[17]。PSII最大光量子效率Fv/Fm的下降常作為衡量光抑制的指標(biāo)，在非脅迫條件下Fv/Fm的正常或最佳值通常在0.83左右[3]。本研究分析得出，大部分脈沖光處理的Fv/Fm值與連續(xù)光沒有顯著性差異，說明這些脈沖光處理未對生菜的光合能力造成傷害，這與Son等[21]的研究結(jié)果一致；而20%占空比、256 Hz以下及40%占空比的部分低頻脈沖光處理的Fv/Fm和Fv/Fo要低于正常水平，原因可能是低頻率和低占空比的脈沖光使得生菜葉片的PSII發(fā)生了光抑制現(xiàn)象。頻率128 Hz及以下低占空比的脈沖光處理生菜葉片qP和Fv′/Fm′低于連續(xù)光，說明低頻低占空比的脈沖光處理降低了生菜PSII反應(yīng)中心的開放程度。低頻低占空比脈沖光下的NPQ明顯高于連續(xù)光和其他脈沖光處理，說明這些脈沖光處理會(huì)導(dǎo)致生菜葉片吸收的光能用于熱耗散的比例上升，而參與光合電子傳遞的能量會(huì)減少，影響了光化學(xué)反應(yīng)的順利進(jìn)行。

Fv/Fm、Fv/Fo、qP、NPQ和Fv′/Fm′這5個(gè)熒光參數(shù)可用來反應(yīng)植物葉片PSII反應(yīng)中心的活性，從試驗(yàn)結(jié)果來看，低頻率低占空比的脈沖光會(huì)導(dǎo)致PSII活性降低，原因可能與暗期時(shí)間有關(guān)。低頻率低占空比的脈沖光的暗期時(shí)間較長，而植株在光期所吸收的光量子數(shù)不足以維持整個(gè)光-暗周期的1,5-二磷酸核酮糖(Ribulose-1,5-bisphosphate，RuBP)緩沖池的能量平衡[22-23]，導(dǎo)致在暗期的后半階段光子數(shù)不足，光合反應(yīng)不能持續(xù)穩(wěn)定下去。這種不平衡會(huì)給植株在某一平均時(shí)間段造成類似于弱光的環(huán)境，對PSII形成了弱光條件下的光抑制，使得PSII的活性降低。相反在高頻率或高占空比的脈沖光下，暗期時(shí)間較短，不會(huì)對植株P(guān)SII的活性造成影響。

3.2 脈沖光對生菜葉片光合電子傳遞的影響

光合作用中受光激發(fā)從H2O中分離出來的電子從PSII出發(fā)，經(jīng)過質(zhì)體醌庫(Plastoquinone pool，PQ pool)、細(xì)胞色素b6f和質(zhì)體藍(lán)素(Plastocyanin，PC)等一系列載體的傳遞，最終產(chǎn)生同化力ATP和NADPH，這些產(chǎn)物為暗反應(yīng)過程提供還原力和能源，將CO2固定并轉(zhuǎn)化為生物可利用的糖類物質(zhì)[24-26]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)ΦPSII、ETR和ΦCO2可用來反映光合作用中光合電子傳遞的情況，且ΦPSII與光合速率直接相關(guān)[27]。

占空比影響LED輻射總時(shí)長和葉片吸收的總光量子數(shù)。在低于256 Hz的脈沖光下，隨著占空比的增加ΦPSII呈現(xiàn)上升的趨勢，說明占空比越高，越有利于促進(jìn)植株葉片的光合電子傳遞效率的提高，這與Dong等[28]的研究結(jié)果一致。CO2同化量子效率ΦCO2和光合電子傳遞速率ETR是判斷光處理影響生菜生長的指標(biāo)，并由直接依賴UPSII參數(shù)的線性方程表示[4]。這意味著，如果ΦPSII增加，參數(shù)ETR和ΦCO2也會(huì)提高。但除了部分高占空比的脈沖光外，其余處理均低于連續(xù)光，這可能與反應(yīng)中心的活性有關(guān)[29]，即低頻率低占空比脈沖光處理下生菜葉片PSII活性降低，導(dǎo)致了電子由PSII反應(yīng)中心向QA、QB和PQ庫的傳遞過程中受到抑制。

相反在256 Hz及以上的高頻和部分低頻高占空比的脈沖光處理對ΦPSII、ETR和ΦCO2無顯著影響，這種情況可能與光合系統(tǒng)中存在的某個(gè)或某些緩沖池有關(guān)[30]。Emerson和Arnold[31]通過觀察不同脈沖光處理下綠色微藻的凈光合速率得出，光反應(yīng)比暗反應(yīng)的反應(yīng)速度快得多。Tennessen等[11]報(bào)道了脈沖光照下番茄葉片的凈光合速率在小于100 Hz 時(shí)隨頻率的降低而下降，并估計(jì)了PSII的池大小。整個(gè)光合系統(tǒng)存在多個(gè)緩沖池，如PQ庫和NADPH池，亦可稱為光合作用的限速步驟[32]。高頻或高占空比脈沖光處理下的參數(shù)ΦPSII、ETR、ΦCO2與連續(xù)光處理沒有顯著差異，可能是植物葉片對于連續(xù)光吸收的光量子有剩余，而剩余的光量子會(huì)以某種光合中間體的形式儲(chǔ)存起來。換句話說，高頻率或高占空比的脈沖光正是充分利用了緩沖池所儲(chǔ)存的中間產(chǎn)物，維持了光反應(yīng)和暗反應(yīng)之間的動(dòng)態(tài)平衡[33]。因此，高頻或高占空比的脈沖光沒有對植物葉片光合系統(tǒng)造成影響。然而，脈沖光通過響應(yīng)其中一個(gè)還是多個(gè)緩沖池來維持穩(wěn)定的光合電子傳遞，至今未有一個(gè)明確的解釋，仍需進(jìn)一步探究。

3.3 脈沖光對生菜葉片PSII能量分配的影響

PSII的量子產(chǎn)額可分為實(shí)際的光化學(xué)量子產(chǎn)額ΦPSII和非光化學(xué)耗散的量子產(chǎn)額ΦNPQ+ΦNO，其中ΦPSII代表PSII吸收后用于光化學(xué)反應(yīng)的那部分能量，且ΦNO+ΦPSII+ΦNPQ=1[34-35]。頻率256 Hz以下除部分高占空比外，非光化學(xué)耗散量ΦNO+ΦNPQ要明顯高于連續(xù)光處理，說明在256 Hz以下低占空比的脈沖光致使生菜葉片吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)的份額會(huì)降低。在1 Hz和2 Hz的低占空比脈沖光下，非調(diào)節(jié)性的能量耗散量子產(chǎn)額ΦNO明顯高于連續(xù)光及其他脈沖光處理，且與其他低頻脈沖光相比，ΦNO在非光化學(xué)耗散量總和中所占的比值要高，可能這種低頻低占空比的脈沖光已經(jīng)使生菜光保護(hù)能力遭到破壞，嚴(yán)重影響了植株葉片的光合作用。而其他處理的ΦNO與連續(xù)光均無顯著性差異，僅僅是在256 Hz以下頻率的ΦNPQ有所增加。ΦNPQ是植物光保護(hù)的重要指標(biāo)，在光能的分配方面，ΦNPQ與ΦPSII呈負(fù)相關(guān)，低頻低占空比的脈沖光導(dǎo)致用于光反應(yīng)的能量降低，而ΦNPQ相應(yīng)的增加說明了植物葉片仍可將無法用于光反應(yīng)的能量轉(zhuǎn)化為熱來保護(hù)自身[36]。另外，在部分低頻高占空比和256 Hz及以上頻率的脈沖光處理下ΦPSII、ΦNPQ和ΦNO三者均與連續(xù)光無顯著差異，說明了在高頻率或高占空比的脈沖光下不會(huì)對生菜葉片PSII反應(yīng)中心的能量分配造成影響。

3.4 LED脈沖光的應(yīng)用對作物生產(chǎn)的影響

隨著植物照明技術(shù)的應(yīng)用，人工補(bǔ)光所帶來的運(yùn)營成本問題也得到了廣泛關(guān)注，其造成的電力消耗就占植物工廠總耗電的75%～80%[37]。脈沖光作為一種高頻率的頻閃光，使得電能節(jié)約成為可能[38]。前期研究發(fā)現(xiàn)，脈沖光占空比一定時(shí)，當(dāng)頻率達(dá)到某一水平，生菜的凈光合速率與連續(xù)光沒有顯著差異[14]，并且本研究進(jìn)一步證實(shí)，在不降低凈光合速率的這些脈沖光中，同樣不會(huì)對作物的光合系統(tǒng)及能量分配造成影響。在不影響光合的前提下，脈沖光的占空比越低，光能利用率就越高。因此，在20%占空比、512 Hz以上的光能利用率能達(dá)到最高。但耗電量并不和光能的總輸出完全一致，LED脈沖光的耗電情況受靜態(tài)功耗(受占空比影響)和動(dòng)態(tài)功耗(受頻率影響)的影響[38]，所以具體的節(jié)能效果仍需結(jié)合LED脈沖光的耗電情況進(jìn)一步探究。此外，本研究結(jié)果僅適用于植物工廠中生菜的種植，其他作物對脈沖光葉綠素?zé)晒獾捻憫?yīng)可能會(huì)有不同，需要通過試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

LED脈沖光在頻率256 Hz以下、占空比20%～60%的低頻低占空比組合的脈沖光會(huì)顯著抑制作物PSII的活性，降低光合電子傳遞速率以及影響能量分配；而256 Hz及以上和80%占空比不會(huì)對作物的葉綠素?zé)晒馓匦栽斐捎绊懀狙芯靠蔀長ED脈沖節(jié)能補(bǔ)光燈的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。