飼糧中添加復(fù)合益生菌對(duì)豬生長(zhǎng)、糞便菌群及代謝產(chǎn)物的影響

趙彥光 張 斌 相德才 劉韶娜

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224)

國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已發(fā)布194號(hào)公告，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。至此，來源廣泛、效果安全和價(jià)格低廉的益生菌逐漸成為研究熱點(diǎn)，也成為無抗飼料中的抗生素替代物之一。益生菌具有促進(jìn)生長(zhǎng)和抗病等作用。目前，雖然益生菌的研究較多[1-3]，但針對(duì)復(fù)合益生菌對(duì)育肥豬腸道菌群和代謝產(chǎn)物影響的研究較少。Lee等[4]研究發(fā)現(xiàn)由來自于新生兒糞便、乳制品的乳桿菌和來源于志愿者糞便中的片球菌復(fù)合而成的復(fù)合益生菌協(xié)同作用具有增強(qiáng)細(xì)胞活素的作用，而其單菌則不具備此作用。鐘曉霞等[5]則發(fā)現(xiàn)由枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、釀酒酵母和丁酸梭菌等4種菌組成的復(fù)合益生菌具有提高斷奶仔豬平均日采食量的作用，王磊等[6]則發(fā)現(xiàn)由分離自山羊腸道的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和釀酒酵母等復(fù)合而成的復(fù)合益生菌具有降低西門塔爾牛血清膽固醇合成和有害菌含量的作用。以上研究多為一種或少數(shù)幾種復(fù)合菌[7-9]，且跨種源應(yīng)用。

雖然復(fù)合益生菌對(duì)豬的生長(zhǎng)和抗病的良好作用報(bào)道，但研究還存在以下問題：益生菌分離來源不清晰；試驗(yàn)動(dòng)物多為外來豬種；地方豬的消化道菌群結(jié)構(gòu)具有特異性，品種間差異較大；部分品種，如藏豬，其對(duì)青綠飼料具有耐受性，適用于集約化養(yǎng)殖的外來豬種的復(fù)合益生菌無法滿足地方豬的需求。且有關(guān)于地方豬適用的復(fù)合益生菌及其如何通過腸道細(xì)菌及代謝產(chǎn)物發(fā)揮益生菌的作用機(jī)理研究，目前鮮見報(bào)道。因此，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)和代謝組學(xué)技術(shù)，研究添加6種分離自云南地方豬的復(fù)合益生菌，對(duì)云南地方育肥豬生長(zhǎng)性能、腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物的影響，以期為益生菌開發(fā)及作用機(jī)理的研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用復(fù)合益生菌制劑為：貝萊斯芽孢桿菌B13(Bacillusvelezensis)、類腸膜魏斯氏菌353(Weissellaparamesenteroides)、賴氨酸芽孢桿菌381(Lysinibacillus)、戊糖片球菌368(Pediococcuspentosaceus)、植物乳桿菌325(Lactobacillusplantarum)和枯草芽孢桿菌386(Bacillussubtilis)，均由本實(shí)驗(yàn)室從迪慶藏豬消化道中分離并保存，將菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，按照等比例混合制成復(fù)合益生菌制劑，每種菌添加量為106CFU/g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)在云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院種豬性能測(cè)試中心完成，選擇無病史、體重(33.75±0.25) kg的“云上飄香豬?”(杜洛克25%×太湖豬25%×迪慶藏豬50%)20頭，按照完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，綜合豬的日齡和體重情況，隨機(jī)分為兩組，每組2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧+復(fù)合益生菌(飼糧中每種菌添加量為106CFU/g，合計(jì)6×106CFU/g，益生菌的用量參考前期試驗(yàn)結(jié)果[3,10])。

1.3 試驗(yàn)日糧與管理

基礎(chǔ)日糧根據(jù)肉脂型豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 65-2004)進(jìn)行配方設(shè)計(jì)，由昆明市東道飼料有限公司根據(jù)試驗(yàn)要求加工，試驗(yàn)豬只自由采食和自由飲水，按照管理規(guī)程免疫，驅(qū)蟲、消毒，試驗(yàn)為21 d，日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of feed (air-dry basis)

1.4 樣品采集

試驗(yàn)期間按照要求對(duì)試驗(yàn)豬只稱重并記錄采食，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算平均日增重，平均日采食量和料重比。試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，在稱重之前，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇3頭豬，收集其糞便樣品，樣品需選擇剛排泄的糞便，用無菌取樣器取中間部分，液氮速凍后，-80 ℃保存，用于后續(xù)分析。

1.5 16S rRNA PCR擴(kuò)增

用總DNA抽提使用試劑盒提取DNA(Omega Bio-tek)，用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000)檢測(cè)DNA濃度和純度；對(duì)V3～V4區(qū)采用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為468 bp。然后回收、純化、洗脫和檢測(cè)(QuantiFluorTM-ST (Promega, USA))。

1.6 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

使用Trimmomatic軟件進(jìn)行序列質(zhì)控。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)，構(gòu)建文庫(PE300)。根據(jù)97%的相似度進(jìn)行OTU聚類，去除單序列和嵌合體，同時(shí)在I-Sanger云平臺(tái)(https:∥cloud.majorbio.com/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋。

1.7 代謝組學(xué)分析

通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS， UPLC-TripleTOF)在正、負(fù)離子模式下檢測(cè)代謝物，采用Progenesis QI (Waters Corporation， Milford, USA)軟件對(duì)代謝物注釋、數(shù)據(jù)預(yù)處理等，結(jié)合t檢驗(yàn)和VIP (OPLS-DA)篩選出差異代謝物，并進(jìn)一步對(duì)差異代謝的生物學(xué)信息進(jìn)行挖掘。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用EXCEL 2007整理，通過SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01和P<0.001均表示差異極顯著。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌對(duì)豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2所示，添加復(fù)合益生菌后，試驗(yàn)組豬的終末體重、平均日增重和平均日采食量均高于對(duì)照組，料重比低于對(duì)照組，但差異均不顯著(P>0.05)。

表2 復(fù)合益生菌對(duì)豬的生長(zhǎng)性能影響Table 2 Effects of complex probiotics on growth performance of pigs

2.2 復(fù)合益生菌對(duì)豬腸道菌群多樣性的影響

2.2.1α多樣性分析

本研究共獲得597 584條高質(zhì)量序列，平均長(zhǎng)度為418.78 nt。按照97 %的相似度聚類，共聚類為1 124個(gè)OTU，歸屬為19個(gè)門，26個(gè)綱，39個(gè)目，71個(gè)科，209個(gè)屬，377個(gè)種。

α多樣性指數(shù)分析見表3，本試驗(yàn)中Coverage指數(shù)都在0.999以上，說明測(cè)序的深度和廣度符合要求。添加復(fù)合益生菌后，試驗(yàn)組的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)顯著升高(P<0.05)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

表3 復(fù)合益生菌對(duì)豬腸道菌群的α多樣性指數(shù)的影響Table 3 Effects of complex probiotics on alpha diversity index of fecal microbiota of pigs

2.2.3β多樣性分析

β多樣性分析通過對(duì)組間不同樣品的微生物多樣性進(jìn)行分析，從而探索試驗(yàn)組和對(duì)照組微生物群落組成的相似性或差異性。基于Unweighted unifrac加權(quán)距離PCoA分析如圖1所示，2個(gè)組的12個(gè)樣品部分重疊未明顯分開，說明飼糧中添加復(fù)合益生菌具有促進(jìn)腸道菌群改變和增加腸道物種豐度的作用。

圖1 基于Unweighted unifrac距離PCoA分析Fig.1 Analysis of PCoA based on Unweighted unifrac distance

2.3 復(fù)合益生菌對(duì)豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1門水平下的優(yōu)勢(shì)菌群分布

門水平下的優(yōu)勢(shì)菌群分析見表4，相對(duì)豐度大于1%的分別為厚壁菌門、擬桿菌門和螺旋體門。90%以上的菌群分布于厚壁菌門和擬桿菌門，添加復(fù)合益生菌后，擬桿菌門相對(duì)豐度極顯著升高(P<0.01)，厚壁菌門/擬桿菌門的比值下降，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 門水平下的優(yōu)勢(shì)菌群豐度分布Table 4 Distribution of dominant microflorain the level of phylum %

2.3.1屬水平下的菌群分布

屬水平下的優(yōu)勢(shì)菌群分析結(jié)果見表5。試驗(yàn)組和對(duì)照組中共計(jì)18種菌的相對(duì)豐度大于1%。添加復(fù)合益生菌后，試驗(yàn)組中理研菌科_RC9腸群的相對(duì)豐度極顯著性提高(P<0.01),其中理研菌科_RC9腸群屬于擬桿菌門。

表5 屬水平下的優(yōu)勢(shì)菌群分布Table 5 Distribution of dominant microflora in the level of genus %

2.3.5復(fù)合益生菌對(duì)豬腸道菌群群落組成差異分析

本研究采用了LEfSe方法對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行了差異分析，結(jié)果顯示：兩組細(xì)菌的相對(duì)豐度差異顯著，LDA值大于2.0時(shí)(圖2)，獲得16個(gè)生物標(biāo)記物，其中試驗(yàn)組獲得6個(gè)生物標(biāo)記物，對(duì)照組獲得10個(gè)。對(duì)照組內(nèi)LDA值最大的是毛螺菌科AC2044群，試驗(yàn)組LDA值最大的是瘤胃球菌科_UCG_014，這兩類是相對(duì)豐度差異最大的細(xì)菌。門水平上，試驗(yàn)組中柔膜菌門的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，綱水平上，試驗(yàn)組的丹毒絲綱的相對(duì)豐度則顯著低于對(duì)照組，而柔膜菌綱則顯著高于對(duì)照組。目水平上，試驗(yàn)組的柔膜菌目_RF39相對(duì)豐度顯著提高，腸桿菌目和丹毒絲目相對(duì)豐度則顯著降低。科水平上，試驗(yàn)組的未命名的丹毒絲菌科_RF39相對(duì)豐度顯著提高，腸桿菌科和丹毒絲菌科則顯著下降。屬水平上，試驗(yàn)組中瘤胃球菌科_UCG_014和未命名的柔膜菌目_RF39相對(duì)豐度顯著上升，毛螺菌科AC2044_群、未命名的丹毒絲菌科、短真桿菌屬群、無甾醇原體屬和大腸埃希菌-志賀菌屬相對(duì)豐度則顯著下降。大腸埃希菌-志賀菌屬為腸道內(nèi)致病菌，添加復(fù)合益生菌后能顯著降低其相對(duì)豐度。

g_Lachnospiraceae_AC2044_group：毛螺菌科_AC2044群；f_Erysipelotrichaceae：丹毒絲菌科；o_Erysipelotrichale：丹毒絲菌目；c_Erysipelotrichia：丹毒絲菌綱；g_norank_f_Erysipelotrichaceae：未命名的丹毒絲菌科；g_Eubacterium_brachy_group：短真桿菌屬群；g_Asteroleplasma：無甾醇原體屬；o_Enterobacteriales：腸桿菌目；f_Enterobacteriaceae：腸桿菌科；g_Escherichia_Shigella：大腸埃希菌-志賀菌屬；g_norank_o_Mollicutes_RF39：未命名的柔膜菌目_RF39屬；f_norank_o_Mollicutes_RF39：未命名的柔膜菌目_RF39科；o_Mollicutes_RF39：柔膜菌目_RF39；c_Mollicutes：柔膜菌綱；g_Ruminococcaceae_UCG_014：瘤胃球菌科_UCG_014；p_Tenericutes：柔膜菌門圖2 復(fù)合益生菌對(duì)豬腸道菌群群落組成差異分析Fig.2 Differences of pig intestinal microbiota composition by adding the complex probiotics

2.4 復(fù)合益生菌對(duì)豬腸道菌群差異代謝產(chǎn)物分析

2.4.1PLS-DA分析

偏最小二乘判別分析(PLS-DA)被用于監(jiān)督和判別分析樣品。正負(fù)離子模式下，R2Y分別為0.839 和0.899，模型可靠。圖3中兩組樣品完全分開且分離度較大，顯示樣品分類效果顯著，給豬飼喂復(fù)合益生菌后，顯著改變了代謝物的組成，陽離子條件下更為明顯。

圖3 正負(fù)離子模式下的PLS-DAFig.3 The PLS-DA chart of positive (a) and negative (b) ion mode

2.4.2代謝物注釋

差異顯著的代謝產(chǎn)物如表6所示，在正負(fù)離子模式下，兩組共檢出804種差異代謝產(chǎn)物，其中正離子條件下的差異代謝產(chǎn)物為434種，與對(duì)照組相比較，304種產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)量上升，130種產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量下降；負(fù)離子條件下的差異代謝產(chǎn)物為370種，其中260個(gè)產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)量上種，110種產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量下降，其中前十種顯著性差異的代謝物見表6。

由表6可知，雌馬酚和磷脂酸是正負(fù)離子模式下相對(duì)表達(dá)量最大的兩個(gè)差異代謝產(chǎn)物，雌馬酚屬于顯著上調(diào)物質(zhì)(P<0.05)，磷脂酸屬于極顯著下調(diào)物質(zhì)(P<0.01)。添加復(fù)合益生菌后，上調(diào)的物質(zhì)有雌馬酚、香豆素K、磷酸甘油-N-棕櫚酰膽胺、磷脂類化合物、5,6-環(huán)氧基-8,11,14-二十碳三烯酸、糖基類化合物和N6-半乳糖基-L-賴氨酸，下調(diào)的物質(zhì)有磷脂酸、肉豆蔻醇和3α-羥基-5β-膽甾-7,9(11)-二亞乙基三胺-24-油酸。

表6 正負(fù)離子模式下豬糞中的差異代謝產(chǎn)物Table 6 The significant different metabolites of positive and negative ion mode

2.4.3差異代謝產(chǎn)物和差異菌群的相關(guān)性分析

采用Pearson分析方法將差異代謝產(chǎn)物和差異菌群進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖4所示，大腸埃希菌-志賀菌屬、丹毒絲菌科和短真桿菌屬群與5,6-環(huán)氧基-8,11,14-二十碳三烯酸(P<0.01)和磷脂類化合物(P<0.05)負(fù)相關(guān)，理研菌科_RC9腸群(P<0.05)、瘤胃球菌科_UCG_014(P<0.01)和柔膜菌目_RF39屬(P<0.01)與磷脂類化合物正相關(guān)，同時(shí)，這三個(gè)菌屬也與5,6-環(huán)氧基-8,11,14-廿碳三烯酸(P<0.05)正相關(guān)；無甾醇原體屬(P<0.05)、大腸埃希菌-志賀菌屬(P<0.01)、丹毒絲菌科(P<0.05)和毛螺菌科_AC2044群(P<0.01)與磷酸甘油-N-棕櫚酰膽胺負(fù)相關(guān)，而瘤胃球菌科_UCG_014和柔膜菌目_RF39屬與其正相關(guān)(P<0.05)；無甾醇原體屬和丹毒絲菌科與雌馬酚負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而瘤胃球菌科_UCG_014和柔膜菌目_RF39屬與其正相關(guān)(P<0.05)；無甾醇原體屬(P<0.01)和毛螺菌科_AC2044群(P<0.05)與香豆素K呈負(fù)相關(guān)，而瘤胃球菌科_UCG_014和柔膜菌目_RF39屬與其正相關(guān)(P<0.05)；無甾醇原體屬(P<0.01)、大腸埃希菌-志賀菌屬(P<0.05)和毛螺菌科_AC2044群(P<0.05)與N6-半乳糖基-L-賴氨酸呈負(fù)相關(guān)，而柔膜菌目_RF39屬則與其正相關(guān)(P<0.05)；無甾醇原體屬(P<0.01)與肉豆蔻醇正相關(guān)，而柔膜菌目_RF39屬則與其負(fù)相關(guān)(P<0.05)；無甾醇原體屬和丹毒絲菌科與磷脂酸正相關(guān)(P<0.05)，理研菌科_RC9腸群(P<0.05)、瘤胃球菌科_UCG_014(P<0.01)和柔膜菌目_RF39屬(P<0.01)與磷脂酸負(fù)相關(guān)；柔膜菌目_RF39屬與3α-羥基-5β-膽甾-7,9(11)-二亞乙基三胺-24-油酸呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

Erysipelotrichaceae：丹毒絲菌科；Eubacterium_brachy_group：短真桿菌屬群；Asteroleplasma：無甾醇原體屬；Escherichia_Shigella：大腸埃希菌-志賀菌屬；Mollicutes_RF39：柔膜菌目_RF39屬；Ruminococcaceae_UCG_014：瘤胃球菌科_UCG_014；Rikenellaceae_RC9_gut-group：理研菌科_RC9腸群；Lachnospiraceae_AC2044_group：毛螺菌科_AC2044群PA(20:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))：磷脂酸；(±)-Equol：雌馬酚；3alpha-Hydroxy-5beta-chola-7,9(11)-dien-24-oic Acid：3α-羥基-5β-膽甾-7,9(11)-二亞乙基三胺-24-油酸；Glycerophospho-N-Palmitoyl Ethanolamine：磷酸甘油-N-棕櫚酰膽胺；LysoPE(20∶3(5Z,8Z,11Z)/0∶0)：磷脂類化合物；N6-Galacturonyl-L-lysine：N6-半乳糖基-L-賴氨酸；Tetradecanol：肉豆蔻醇；Pisatoside：糖基類化合物；Neoacrimarine K：香豆素K；5,6-Epoxy-8,11,14-eicosatrienoic acid：5,6-環(huán)氧基-8,11,14-二十碳三烯酸；*：差異顯著(P<0.05)；**：差異極顯著(P<0.01)；***：差異極顯著(P<0.001)*: Significantly different (P<0.05); **: Extremly different (P<0.01); ***: Extremly different (P<0.001)圖4 差異菌群與差異代謝產(chǎn)物的關(guān)聯(lián)分析Fig.4 Correlation analysis between microbiota and metabolites

理研菌科_RC9腸群、瘤胃球菌科_UCG_014和柔膜菌目_RF39屬與3α-羥基-5β-膽甾-7,9(11)-二亞乙基三胺-24-油酸、磷脂酸和肉豆蔻醇呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，與香豆素K、N6-半乳糖基-L-賴氨酸、糖基類化合物、雌馬酚、磷酸甘油-N-棕櫚酰膽胺、磷脂類化合物和5,6-環(huán)氧基-8,11,14-二十碳三烯酸呈正相關(guān)趨勢(shì)；而無甾醇原體屬、短真桿菌屬群、大腸埃希菌-志賀菌屬(P<0.05)、丹毒絲菌科和毛螺菌科_AC2044群與這十種代謝物的相關(guān)趨勢(shì)則相反。

3 討 論

3.1 復(fù)合益生菌對(duì)豬生長(zhǎng)性能的影響

益生菌具有抗病促生長(zhǎng)的作用。目前已報(bào)道的益生菌有芽孢桿菌、雙歧桿菌、乳酸菌和酵母菌等。但由于菌的品種、添加劑量、試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)環(huán)境等的差異性，試驗(yàn)結(jié)果也不完全相同。解淀粉芽孢桿菌能提高患高白斑病毒感染小龍蝦的成活率[11]，提高雞的精子質(zhì)量和卵子的孵化率[12]，并能抑制奇異變形桿菌的生長(zhǎng)[13]；枯草芽孢桿菌具有提高育肥豬的日增重和降低料重比的作用[14]。乳酸菌是青貯中常用菌[15]，具有隔離病菌的生物膜作用[16]，酵母菌能提高其生物活性[17]，能促進(jìn)生長(zhǎng)，促進(jìn)免疫應(yīng)答和抗病[18]。李宗凱等[19]發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳酸菌和枯草芽孢桿菌能顯著提高結(jié)腸中瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度，顯著提高生長(zhǎng)期豬的日增重、日采食量和終末體重的作用，對(duì)育肥期豬的生長(zhǎng)性能具有提高趨勢(shì)，但差異不顯著。李浩等[20]研究發(fā)現(xiàn)由枯草芽孢桿菌、糞腸球菌和丁酸梭菌組成的復(fù)合益生菌能提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率，對(duì)豬生長(zhǎng)性能的促進(jìn)作用需要隨時(shí)間的推移逐漸顯現(xiàn)。芽孢桿菌和乳酸菌類是復(fù)合益生菌中常用的菌種，本研究中復(fù)合益生菌的種類也主要集中在這兩類，研究用菌均來源于半放牧模式的云南地方豬(迪慶藏豬等)消化道，復(fù)合后又應(yīng)用于云南地方豬，理論上具有更好的適應(yīng)性。種類上選擇具有協(xié)同性的菌，主要由貝萊斯芽孢桿菌、類腸膜魏斯氏菌、賴氨酸芽孢桿菌、戊糖片球菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌組成，其種類較以往研究更為豐富，其中貝萊斯芽孢桿菌和類腸膜魏斯氏菌在豬上的應(yīng)用較為罕見，但在高海拔地區(qū)豬消化道較為常見。本研究選擇6種地方豬消化道中優(yōu)勢(shì)菌，旨在更好地應(yīng)用于云南地方豬，促進(jìn)其健康養(yǎng)殖，提高試驗(yàn)豬只的生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能，這其中貝萊斯芽孢桿菌具有顯著提高短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌和促進(jìn)乳桿菌生長(zhǎng)，抑制條件致病菌鏈球菌的功能[3]，戊糖片球菌則具有提高抗病菌并降低鏈球菌屬等條件致病菌的相對(duì)豐度的作用[10]，此6種菌相互協(xié)同，共同發(fā)揮益生作用，且在超早期斷奶仔豬中應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌具有提高斷奶仔豬腸道微生物結(jié)構(gòu)向成年豬轉(zhuǎn)化速率的趨勢(shì)，對(duì)于斷奶應(yīng)激造成的腸道菌群失衡，能夠更快速地建立新的平衡。本研究表明，添加復(fù)合益生菌后，可提高生長(zhǎng)性能，但差異不顯著，可顯著改變菌群結(jié)構(gòu)和代謝物質(zhì)，說明添加益生菌具有提高生長(zhǎng)性能和抗病的趨勢(shì)，后期應(yīng)該就時(shí)間、添加劑量及微生物之間的配比繼續(xù)研究，使這種趨勢(shì)呈現(xiàn)顯著性變化，以期為復(fù)合益生菌更好地應(yīng)用提供依據(jù)。

3.2 復(fù)合益生菌對(duì)豬糞便菌群的影響

腸道微生物與宿主的營養(yǎng)代謝和免疫功能[21]及疾病顯著相關(guān)[22-24]。腸道菌群的結(jié)構(gòu)和豐度與營養(yǎng)和代謝疾病等顯著相關(guān)，越來越多的學(xué)者也關(guān)注菌群的比例與機(jī)體營養(yǎng)代謝和疾病等相關(guān)性，其中厚壁菌門/擬桿菌門的豐度比值是近年來關(guān)注的熱點(diǎn)。厚壁菌門/擬桿菌門的比值與病理性肥胖[25]和脂肪的貯存[26-27]呈正相關(guān)，高脂食物能可提高其比值[28]，菌群代謝產(chǎn)物丁酸鈉[29]、菊粉等益生元[30]和植物乳桿菌等特定益生菌[31]可降低其比值。Lee等[7]發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌可以緩解小鼠脂肪肝，顯著降低肝臟/體重比值和厚壁菌門/擬桿菌門的比值。本研究在育肥豬飼糧中添加6種益生菌組合的復(fù)合益生菌后，厚壁菌門與擬桿菌門的比值下降，但差異不顯著，說明添加復(fù)合益生菌或具有促進(jìn)厚壁菌門/擬桿菌門的比值下降的趨勢(shì)，但是否能達(dá)到顯著性差異，后期應(yīng)該關(guān)注并探討試驗(yàn)動(dòng)物、試驗(yàn)時(shí)間及復(fù)合菌的濃度等試驗(yàn)因素對(duì)結(jié)果的影響程度。

理研菌科是腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌，與黏蛋白降解相關(guān)[32]，與機(jī)體肥胖顯著呈負(fù)相關(guān)[33-34]，對(duì)腸道黏膜健康具有重要作用。瘤胃球菌屬是豬腸道內(nèi)常見的腸道共生菌，菌體表面可表達(dá)2種“超級(jí)抗原”蛋白，分別為IbpA(熱激蛋白A)和IbpB(熱激蛋白B)，在體外可以激活表達(dá)B細(xì)胞，體內(nèi)可以激活免疫球蛋白IgA[35]，同時(shí)理研菌科相對(duì)豐度與宿主的飼料利用率、揮發(fā)性脂肪酸和短鏈脂肪酸的代謝呈正相關(guān)[36-37]，與胰島素水平[38]和干擾素IFNγ[39]等炎癥相關(guān)免疫基因的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。瘤胃球菌屬是腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌，能夠利用糖結(jié)合蛋白(RgCBM40)與杯狀細(xì)胞分泌的黏液及純化的黏液蛋白結(jié)合，并以唾液酸為媒介，降解黏液蛋白[40]。還能產(chǎn)生瘤胃球菌素C1(RumC1)，通過抑制核酸合成而抗致病性梭菌和多重耐藥菌[41]。本研究發(fā)現(xiàn)添加復(fù)合益生菌后，極顯著提高了理研菌科_RC9腸群的相對(duì)豐度，顯著提高了瘤胃球菌科_UCG_014的相對(duì)豐度。此二種菌均與黏蛋白的降解正相關(guān)，與腸道粘膜健康具有重要作用，對(duì)維護(hù)腸道健康具有促進(jìn)作用，試驗(yàn)結(jié)果提示，添加復(fù)合益生菌對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮維護(hù)粘膜健康，抵抗有害菌具有促進(jìn)作用。理研氏菌科的相對(duì)豐度上升和厚壁菌門/擬桿菌門比值的下降趨勢(shì)提示添加復(fù)合益生菌或?qū)ωi的脂肪含量具有一定的控制作用，但還需后續(xù)屠宰試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.3 復(fù)合益生菌對(duì)豬腸道代謝物質(zhì)的影響

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要器官。在試驗(yàn)動(dòng)物和飼料基本相同的前提條件下，由于腸道內(nèi)微生物的結(jié)構(gòu)和豐度等差異而導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的差異，目前還是研究的熱點(diǎn)問題。本研究發(fā)現(xiàn)添加復(fù)合益生菌后，糞便中雌馬酚和香豆素K等物質(zhì)的相對(duì)含量顯著或極顯著上調(diào)。雌馬酚對(duì)血清和尿液代謝物具有顯著影響，與心腦血管和代謝疾病負(fù)相關(guān)[42]。香豆素具有拮抗細(xì)菌和真菌的作用[43]，能促進(jìn)黃曲霉毒素降解菌的生長(zhǎng)[44]，對(duì)全齒復(fù)活線蟲具有致死性[45]。相關(guān)性分析數(shù)據(jù)顯示此二者代謝產(chǎn)物均與瘤胃球菌科_UCG_014和不同分類水平的柔膜菌顯著正相關(guān)。從而可知，添加復(fù)合益生菌或通過促進(jìn)瘤胃球菌科_UCG_014等菌相對(duì)豐度從而促進(jìn)糞便中雌馬酚和香豆素含量的提高。

4 結(jié) 論

豬飼糧中添加來源于迪慶藏豬消化道的6種益生菌組合的復(fù)合益生菌可提高育肥豬糞菌的α多樣性，豐富菌群的結(jié)構(gòu)，并在屬水平上可極顯著提高理研菌科_RC9腸群的相對(duì)豐度，提高與心腦血管和代謝疾病負(fù)相關(guān)物質(zhì)(雌馬酚)和抗菌物質(zhì)(香豆素K)的含量，具有潛在抗病和抗菌的趨勢(shì)。