福氏志賀菌來(lái)源L-鼠李樹(shù)膠糖激酶的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析

馮林雪，陳洲，王亞森，馮康，許向陽(yáng)，李子杰*，中西秀樹(shù)*，高曉冬

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(棗莊市杰諾生物酶有限公司，山東 棗莊，277100)

D-阿洛酮糖是一種稀有糖[1]，是D-果糖的C-3差向異構(gòu)體，主要來(lái)源于少部分植物和細(xì)菌。D-阿洛酮糖除具有低能量、改善腸道菌群、抗齲齒等生理功能[2-4]外，還在抑制血糖升高與體脂積累、清除自由基、神經(jīng)保護(hù)等諸多方面發(fā)揮著重要生理活性作用[5-10]。D-阿洛酮糖甜度可達(dá)到果糖的70%[11]，能量只有蔗糖的0.3%[12]，是一種新型甜味劑[13-15]，尤其適用于糖尿病及肥胖癥人群[16]。目前其生產(chǎn)主要依賴生物轉(zhuǎn)化法，即以D-果糖為底物，在D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-psicose-3-epimerase，DPE)的催化作用下將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖[17-18]，但該反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低，約為30%。為了提高轉(zhuǎn)化率，WEN等[19]建立了一種“磷酸化-脫磷酸”級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即將DPE與L-鼠李樹(shù)膠糖激酶(L-rhamnulose kinase，RhaB)偶聯(lián)，利用RhaB催化D-阿洛酮糖為D-阿洛酮糖1-磷酸，后者再通過(guò)磷酸酶將D-阿洛酮糖1-磷酸脫磷酸為D-阿洛酮糖，通過(guò)該級(jí)聯(lián)反應(yīng)可大大提高D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率。

RhaB屬于己糖激酶-肌動(dòng)蛋白-hsp70家族的一種[20]，在N端及C端都有5股β折疊，在它們的間隙處有ATP結(jié)合位點(diǎn)[21-27]。RhaB可以磷酸化C-3構(gòu)型為R型的稀有糖，但對(duì)C-3構(gòu)型為S構(gòu)型的糖無(wú)活性[19]。近年來(lái)，RhaB被用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn)，通過(guò)RhaB的引入，可大大提高D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率[19, 28-30]。

鑒于目前對(duì)于RhaB的研究較少且其在D-阿洛酮糖合成中有重要應(yīng)用，本研究從福氏志賀菌(Shigellaflexneri2a str.301)的基因組DNA中克隆得到了rhaB基因(Gene ID：1025156)并對(duì)其進(jìn)行改良，對(duì)突變體酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了一系列分析。將RhaB與D-阿洛酮糖進(jìn)行分子對(duì)接，初步研究了RhaB的催化機(jī)制，為其在D-阿洛酮糖生產(chǎn)方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌EscherichiacoliXL10-gold、BL21(DE3)及福氏志賀菌(Shigellaflexneri2a str.301)基因組，本實(shí)驗(yàn)室保存；菌株BL21(DE3)/pET28a-rhaB、菌株BL21(DE3)/pET28a-rhaBE437Q，本研究構(gòu)建。

1.1.2 酶試劑及耗材

PCR所需試劑(Prime STAR)、限制性內(nèi)切酶，寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；PCR所需試劑(KOD FX Neo)，日本東洋紡公司(TOYOBO)；ATP、D-果糖，上海生工生物公司；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒(12 000～200 000 Da)，Sigma-Aldrich公司；Ni2+親和層析柱，GE公司；各種稀有糖，TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；薄層色譜(thin-layer chromatography，TLC)薄層層析板60 F254，德國(guó)默克公司；Sugar-PakTM色譜分析柱(300 mm×6.5 mm)，美國(guó)Waters公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及其他溶液的配制

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂粉20(固體培養(yǎng)基)，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，15 min)。

TB培養(yǎng)基：酵母提取物24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，甘油體積分?jǐn)?shù)為0.4%，K2HPO412.53 g/L，KH2PO42.31 g/L，營(yíng)養(yǎng)成分和鹽分開(kāi)高壓蒸汽滅菌(121 ℃，15 min)后混勻。

蛋白純化緩沖液：裂解、平衡緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl；洗滌緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，60 mmol/L咪唑；洗脫緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑；脫鹽緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，50 mmol/L NaCl。

1.1.4 儀器與設(shè)備

AG 22331 Hamburg PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；PAC300電泳儀Bio-Rad Power，美國(guó)伯樂(lè)公司；E2695 HPLC，美國(guó)Waters公司；VCX 750超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，南京新辰生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用Prime STAR聚合酶進(jìn)行PCR 時(shí)，以福氏志賀菌(S.flexneri2a str.301)基因組為模板，以rhaB-F:GCGCGGATTCATGACCTTTCGCAATTGTGT(BamH Ⅰ)為上游引物，以rhaB-R:ATATCCATGGTCATGCGCAAAGCTCCTTTG(Hind Ⅲ)為下游引物進(jìn)行PCR得到目的基因，目的基因與pET28a載體經(jīng)雙酶切后將載體與目的基因用DNA連接酶Ligation-mix于25 ℃靜置20 min連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL10-gold感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上25 min，42 ℃熱激40 s，冰上放置3 min后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至LB[卡那霉素(kanamycin,Kan)](50 μg/mL)平板。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證最后送測(cè)序。pET28a-rhaBE437Q的構(gòu)建所用PCR試劑為KOD FX Neo，以pET28a-rhaB為模板，以RhaBE437Q-F:GGCAATATCGGCATCCAGTTAATGACGCTGGAT為上游引物，以RhaBE437Q-R:ATCCAGCGTCATTAACTGGATGCCGATATTGCC為下游引物進(jìn)行PCR，用去甲基化酶DpnⅠ消化掉PCR產(chǎn)物中的模板質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL10-gold感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并測(cè)序。

1.2.2 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將上述測(cè)序成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布至LB(Kan)(50 μg/mL)平板37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種至5 mL LB(Kan)(50 μg/mL)培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，后以1%接種量轉(zhuǎn)接至200 mL TB(Kan)(50 μg/mL)培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h左右待OD600為0.6～0.8，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG轉(zhuǎn)入16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h，收集菌體置于-20 ℃?zhèn)溆?分別取500 μL誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后菌體用于后續(xù)SDS-PAGE檢測(cè))。

1.2.3 重組蛋白的分離純化

將菌體重懸于預(yù)先預(yù)冷的裝有10 mL裂解緩沖液的50 mL離心管中，冰上超聲破碎，破碎2 s，間歇2 s，總時(shí)間30 min，顯微鏡下觀察菌體是否破碎。將破碎液于低溫條件下進(jìn)行高速離心，得到的上清液和沉淀分別取樣，上清液用于蛋白的純化。采用Ni2+親和層析的方法進(jìn)行純化(5 mL HisTrpTMHP)，純化步驟如下：(1)用30 mL無(wú)菌水清洗柱子；(2)10 mL 0.1 mol/L的NiSO4再生柱子；(3)20 mL無(wú)菌水洗去未結(jié)合的Ni2+；(4)20 mL平衡緩沖液平衡柱子；(5)緩慢上樣，使蛋白與柱子充分結(jié)合；(6)20 mL平衡緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白；(7)20 mL低濃度咪唑洗去結(jié)合能力較弱的雜蛋白；(8)20 mL高濃度咪唑洗去目標(biāo)蛋白并收集。收集到的蛋白含有較多鹽，因此將蛋白進(jìn)行脫鹽處理。將收集到的目標(biāo)蛋白用超濾管(10 kDa)進(jìn)行濃縮(3 600×g，4 ℃離心一定時(shí)間)，加入脫鹽緩沖液，濃縮到一定體積后加入終體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油并測(cè)濃度，后分裝為小管置于-20 ℃保存。

1.2.4 重組蛋白R(shí)haB的氨基酸序列分析

將福氏志賀菌(S.flexneri2a str.301)來(lái)源的RhaB蛋白(RhaB-Sf2a str.301，蛋白ID NP_709708)與福氏志賀菌(S.flexneri)來(lái)源的RhaB蛋白(RhaB-Sf，蛋白ID WP_039062492.1)，大腸桿菌(E.coli)來(lái)源的RhaB蛋白(RhaB-E.coli，蛋白ID WP_000144054.1)通過(guò)CLC Sequence viewer進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.5 重組蛋白R(shí)haB及RhaBE437Q活性的測(cè)定

整個(gè)酶反應(yīng)體系體積為250 μL，其中底物D-阿洛酮糖5 g/L，MnSO45 mmol/L，ATP 27 mmol/L，重組蛋白0.2 mg/mL，50 mmol/L pH 8.5的Tris-HCl補(bǔ)足至250 μL。37 ℃反應(yīng)10 min，100 ℃加熱10 min終止反應(yīng)。取0.5 μL反應(yīng)液進(jìn)行TLC檢測(cè)，展開(kāi)劑為V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=2∶1∶1的混合液。用茴香醛染色檢測(cè)D-阿洛酮糖1-磷酸的生成。取余下反應(yīng)液離心(15 000 r/min，10 min)，取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜進(jìn)行HPLC檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)中D-阿洛酮糖的減少量來(lái)定義酶活性。檢測(cè)條件為：Sugar-PakTM色譜柱，流動(dòng)相為500 mg/L的EDTA鈣鹽，流速為0.5 mL/min，柱溫為80 ℃，示差檢測(cè)器。

1.2.6 重組蛋白(RhaBE437Q)分子質(zhì)量的檢測(cè)

采用SDS-PAGE(5%濃縮膠、10%分離膠)進(jìn)行重組蛋白單亞基分子質(zhì)量的測(cè)定，考馬斯亮藍(lán)染色。采用凝膠過(guò)濾層析檢測(cè)整體的蛋白分子質(zhì)量，檢測(cè)條件：TSK G3000SWXL凝膠柱，流動(dòng)相為PBS溶液，流速為0.5 mL/min，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

1.2.7 重組蛋白(RhaBE437Q)最適反應(yīng)條件的測(cè)定

整個(gè)酶反應(yīng)體系體積為250 μL，其中底物D-阿洛酮糖5 g/L，MnSO45 mmol/L，ATP 30 mmol/L，重組蛋白R(shí)haBE437Q0.2 mg/mL，50 mmol/L pH 8.5的Tris-HCl補(bǔ)足至250 μL。不同溫度條件下反應(yīng)5 min，100 ℃ 加熱10 min終止反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)后D-阿洛酮糖的減少量。采用不同pH的緩沖液進(jìn)行最適pH的測(cè)定，其中pH 6～7為磷酸鹽緩沖液，pH 7～8.5為Tris-HCl緩沖液，pH 8.5～10為Gly-NaOH緩沖液。測(cè)定最適金屬離子時(shí)，先將重組蛋白R(shí)haBE437Q用含有50 mmol/L EDTA的Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.0)溶液透析12 h以除去金屬離子，然后再用不含EDTA的Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.0)溶液透析12 h除去EDTA，選用Zn2+、Co2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Mg2+7種離子及EDTA測(cè)定酶活性。

1.2.8 重組蛋白(RhaBE437Q)底物特異性的測(cè)定

以不同稀有糖為底物(D/L-果糖，D/L-阿洛酮糖，D/L-山梨糖，D/L-塔格糖)，酶反應(yīng)體系同酶活性測(cè)定，40 ℃反應(yīng)5 min，HPLC檢測(cè)糖的減少量，對(duì)D-阿洛酮糖的活性定義為100%，測(cè)定重組蛋白R(shí)haBE437Q對(duì)D-阿洛酮糖的活性以及對(duì)其他糖的相對(duì)活性。

1.2.9 重組蛋白R(shí)haBE437Q對(duì)D-阿洛酮糖催化機(jī)理的分析

采用SWISS-MODEL 在線程序(https://swissmodel.expasy.org/)，以大腸桿菌來(lái)源RhaB為模板(PDB：2cgl.1.A，同源性98.57%)同源建模得到RhaBE437Q蛋白結(jié)構(gòu)模型。后將D-阿洛酮糖與重組蛋白R(shí)haBE437Q蛋白結(jié)構(gòu)模型利用AutoDock軟件[31]進(jìn)行分子對(duì)接，利用Pymol分析其催化機(jī)理。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白R(shí)haB的氨基酸序列分析

序列比對(duì)(圖1)顯示，2種福氏志賀菌來(lái)源RhaB-Sf2a str.301與RhaB-Sf的氨基酸序列具有高度保守性，僅在437號(hào)氨基酸位點(diǎn)存在差異。RhaB-Sf2a str.301 第437號(hào)位點(diǎn)氨基酸為谷氨酸(E)，而RhaB-Sf該位點(diǎn)氨基酸為谷氨酰胺(Q)，且大腸桿菌來(lái)源RhaB-E.coli該位點(diǎn)氨基酸也為谷氨酰胺(Q)，因此將RhaB-Sf2a str.301第437號(hào)氨基酸位點(diǎn)的谷氨酸(E)突變?yōu)楣劝滨０?Q)。

2.2 重組蛋白R(shí)haB、RhaBE437Q的表達(dá)純化

RhaB、RhaBE437Q理論等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)和分子質(zhì)量(Mw)分別為pI 5.03/54 050.04 Da(RhaB)，pI 5.08/54 049.05 Da(RhaBE437Q)(www.Expasy.Org)。由SDS-PAGE結(jié)果(圖2)可知，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，RhaB、RhaBE437Q蛋白在50～70 kDa均有清晰的目的條帶，因此二者在大腸桿菌中均成功表達(dá)。與RhaB蛋白相比，RhaBE437Q蛋白更多的以可溶性蛋白的方式存在；而RhaB蛋白大多以包涵體形式存在，僅存在極少部分的可溶性蛋白。

2.3 重組蛋白R(shí)haB、RhaBE437Q的活性檢測(cè)

以D-阿洛酮糖為底物，RhaB蛋白可將D-阿洛酮糖磷酸化生成D-阿洛酮糖1-磷酸。由于D-阿洛酮糖和其磷酸糖極性相差較大，因此可通過(guò)TLC來(lái)檢測(cè)。TLC結(jié)果如圖3所示，大腸桿菌來(lái)源的RhaB蛋白催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛酮糖1-磷酸，在D-阿洛酮糖下方可看到清晰的磷酸糖的點(diǎn)(如圖3中箭頭所示)；而福氏志賀菌(S.flexneri2a str.301)來(lái)源的RhaB蛋白對(duì)D-阿洛酮糖幾乎無(wú)活性，從TLC圖(圖3-a)看不到磷酸糖的生成；而RhaBE37Q蛋白與大腸桿菌來(lái)源的RhaB蛋白相比，可看到幾乎相同量磷酸糖的產(chǎn)生(圖3-b)。同時(shí)通過(guò)HPLC檢測(cè)D-阿洛酮糖的減少量(圖4)，發(fā)現(xiàn)突變體蛋白活性為未突變蛋白的10倍。因此推測(cè)福氏志賀菌(S.flexneri2a str.301)來(lái)源的RhaB蛋白第437號(hào)位點(diǎn)氨基酸是影響其表達(dá)及活性的關(guān)鍵氨基酸。

M-蛋白Marker；1-誘導(dǎo)前全細(xì)胞；2-誘導(dǎo)20 h的全細(xì)胞； 3-細(xì)胞裂解液上清液；4-細(xì)胞裂解沉淀；5-純化后蛋白 a-突變前；b-突變后圖2 SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白R(shí)haB/RhaBE437Q的表達(dá)和純化Fig.2 SDS-PAGE analysis of RhaB/RhaBE437Q expression and purification

1-D-阿洛酮糖標(biāo)樣；2-大腸桿菌來(lái)源RhaB蛋白催化 D-阿洛酮糖反應(yīng)液；3-福氏志賀菌來(lái)源RhaB/RhaBE437Q 蛋白催化D-阿洛酮糖反應(yīng)液 a-RhaB；b-RhaBE437Q圖3 TLC檢測(cè)RhaB及RhaBE437Q蛋白活性Fig.3 TLC analysis of the activities of RhaB and RhaBE437Q 注：圖中箭頭所指表示磷酸糖(圖7同)

1-反應(yīng)前；2-RhaB反應(yīng)5 min；3-RhaBE437Q反應(yīng)5 min圖4 HPLC檢測(cè)RhaB及RhaBE437Q蛋白活性Fig.4 HPLC analysis of the activities of RhaB and RhaBE437Q

2.4 重組蛋白R(shí)haBE437Q分子質(zhì)量的確定

通過(guò)SDS-PAGE可知RhaBE437Q蛋白單個(gè)亞基分子質(zhì)量約為54 kDa(圖2-b)，整體蛋白分子質(zhì)量通過(guò)凝膠柱(TSK G3000SWXL)分析計(jì)算可知約為58 kDa(圖5)，因此福氏志賀菌(S.flexneri2a str.301)來(lái)源的RhaBE437Q與大腸桿菌來(lái)源的RhaB蛋白[32]一樣，均為單體蛋白。

2.5 金屬離子、溫度、pH對(duì)重組蛋白R(shí)haBE437Q活性的影響

金屬離子、溫度、pH對(duì)于酶促反應(yīng)具有重要影響。由圖6-a可知，Mn2+對(duì)反應(yīng)的促進(jìn)作用最為明顯。除Mn2+和Mg2+外，其余金屬離子對(duì)酶催化幾乎無(wú)促進(jìn)作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大腸桿菌來(lái)源的RhaB最適反應(yīng)溫度為35 ℃，最適pH值為8.0[29]。在10～60 ℃，測(cè)定重組蛋白R(shí)haBE437Q的最適反應(yīng)溫度，結(jié)果如圖6-b所示，重組蛋白R(shí)haBE437Q的最適反應(yīng)溫度為40 ℃；在20～50 ℃，重組蛋白R(shí)haBE437Q仍保留50%以上的活性；但當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，酶活性降低較為明顯，說(shuō)明隨著溫度升高，溫度對(duì)酶結(jié)構(gòu)影響較大，是影響酶活性的主要因素。在pH 6～10測(cè)定反應(yīng)的最適pH，由圖6-c可知，反應(yīng)的最適pH值為8.5，且在該范圍內(nèi)重組蛋白R(shí)haBE437Q均可保持60%以上的酶活性，說(shuō)明重組蛋白R(shí)haBE437Q有較寬泛的pH耐受性。

圖5 RhaBE437Q蛋白分子質(zhì)量的測(cè)定Fig.5 Gel filtration chromatography analysis of RhaBE437Q′s molecular mass注：標(biāo)準(zhǔn)蛋白包括葡聚糖(2 000 kDa)，β-淀粉酶(200 kDa)， 乙醇脫氫酶(150 kDa)，碳酸酐酶(29 kDa)，細(xì)胞色素c(12.4 kDa)

a-金屬離子；b-溫度；c-pH圖6 金屬離子、溫度、pH對(duì)RhaBE437Q活性的影響Fig.6 Effect of metal ions, temperature and pH on the activity of RhaBE437Q

2.6 重組蛋白R(shí)haBE437Q底物特異性的分析

以不同的稀有糖為底物，通過(guò)TLC檢測(cè)磷酸糖的產(chǎn)生來(lái)分析重組蛋白R(shí)haBE437Q的底物特異性。由TLC結(jié)果可知(圖7)，重組蛋白R(shí)haBE437Q與D-阿洛酮糖、L-果糖、D-山梨糖、L-塔格糖反應(yīng)均有磷酸糖的產(chǎn)生(如圖7中黑色箭頭所示)，而與L-阿洛酮糖、D-果糖、L-山梨糖、D-塔格糖反應(yīng)無(wú)磷酸糖產(chǎn)生。與文獻(xiàn)報(bào)道一致，RhaB蛋白只能催化C-3構(gòu)型為R構(gòu)型的稀有糖[20]。經(jīng)HPLC檢測(cè)反應(yīng)中糖的減少量，對(duì)D-阿洛酮糖活性定義為100%，則L-果糖、D-山梨糖、L-塔格糖的相對(duì)活性分別為76%、77%、102%。

1-D-果糖；2-D-阿洛酮糖；3-L-阿洛酮糖； 4-L-果糖；5-D-山梨糖；6-L-塔格糖； 7-L-山梨糖；8-D-塔格糖圖7 TLC檢測(cè)RhaBE437Q底物特異性Fig.7 TLC analysis of substrate specificity of RhaBE437Q

2.7 重組蛋白R(shí)haBE437Q對(duì)D-阿洛酮糖催化機(jī)理的分析

RhaBE437Q蛋白結(jié)構(gòu)模型和D-阿洛酮糖分子對(duì)接結(jié)果如圖8所示，該模型可清晰的看出RhaBE437Q的結(jié)構(gòu)，ADP、PO3及底物D-阿洛酮糖的位置。重組蛋白R(shí)haBE437Q在N端及C端都有β折疊，ADP位于其間隙處。PO3為ATP結(jié)合位點(diǎn)，位于ADP和D-阿洛酮糖之間。底物D-阿洛酮糖位于蛋白的中心。437號(hào)氨基酸突變位點(diǎn)雖遠(yuǎn)離活性中心及底物結(jié)合口袋，但對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)及活性產(chǎn)生了很大影響，類似于XIE等[33]對(duì)辛伐他汀合酶的改造結(jié)果。推測(cè)該位點(diǎn)為暴露在溶劑中的氨基酸位點(diǎn)，突變后降低了蛋白質(zhì)的聚合作用，改善了蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，因此改變了蛋白質(zhì)的表達(dá)水平及活性。由圖9可知，底物D-阿洛酮糖與RhaBE437Q結(jié)合位點(diǎn)周圍的氨基酸有Gly83、His236、Asp237、Thr238、Trp260、Asn296。底物D-阿洛酮糖與重組蛋白R(shí)haBE437Q的Gly83、His236、Asp237、Thr238氨基酸形成氫鍵，同時(shí)，底物D-阿洛酮糖與重組蛋白R(shí)haBE437Q在Phe134、Glu284、Leu132、Trp82、Leu262位點(diǎn)之間有范德華力的產(chǎn)生。但范德華力與氫鍵相比作用力較弱，因此主要的分子間相互作用仍為氫鍵。這些氨基酸可能在酶與底物的結(jié)合和催化過(guò)程中起著重要作用，可為進(jìn)一步飽和突變驗(yàn)證酶活性中心關(guān)鍵殘基提供指導(dǎo)。

圖8 重組蛋白R(shí)haBE437Q與D-阿洛酮糖的對(duì)接模型Fig.8 The overall position model of D-allulose binding on RhaBE437Q

a-D-阿洛酮糖與重組蛋白R(shí)haBE437Q之間氨基酸殘基三維譜圖； b-D-阿洛酮糖與重組蛋白R(shí)haBE437Q之間相互作用力二維譜圖圖9 重組蛋白R(shí)haBE437Q與D-阿洛酮糖的結(jié)合位點(diǎn)Fig.9 Binding site of D-allulose on RhaBE437Q

3 結(jié)論

從福氏志賀菌(S.flexneri2a str.301)中克隆得到了rhaB基因，對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變得到rhaBE437Q基因，并成功在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，利用鎳離子親和層析柱對(duì)突變體蛋白進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)突變體蛋白可溶性及活性均得到很大改善。研究了突變體蛋白的酶學(xué)性質(zhì)：突變蛋白為單體；其最優(yōu)反應(yīng)條件為40 ℃，pH 8.5，Mn2+；突變體蛋白對(duì)C-3構(gòu)型為R構(gòu)型的糖有催化作用；將其與底物D-阿洛酮糖進(jìn)行分子對(duì)接，酶活性中心Gly83、His236、Asp237、Thr238等殘基與D-阿洛酮糖間存在氫鍵作用，推測(cè)是影響酶催化的關(guān)鍵殘基，可進(jìn)行進(jìn)一步突變驗(yàn)證。重組蛋白R(shí)haBE437Q的研究可為工業(yè)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖提供更多方法。