保寧醋“中藥醋曲”發酵過程中微生物數量及理化性質動態分析

嚴唯瑋，黃靜，肖蕾，汪明，袁碩，李建龍，劉愛平，敖曉琳，劉書亮*，陳蓉，杜大釗

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)2(四川保寧醋有限公司，四川 閬中，637400)

保寧醋是四川麩醋的典型代表，作為我國四大名醋中唯一的藥醋，中藥制曲是其生產工藝中較為重要的一環[1]。保寧醋“中藥醋曲”傳承白酒大曲的制作工藝，以麩皮、玉米、小麥、大米及藥食同源的中草藥等為原料，通過自然固態發酵方式富集多種微生物，使菌群在醋曲中代謝產生食醋發酵需要的酶類及風味物質或風味前體物質。

大曲是食醋釀造過程中不可或缺的糖化發酵劑。傳統食醋大曲的固態發酵過程可分為臥曲、上霉、晾霉、潮火、大火、后火、養曲等7個階段，整個過程菌系、物系、酶系復雜多變[2]，其中菌系幾乎囊括了食醋釀造所需的全部微生物，如細菌、酵母菌、霉菌等[3-4]。微生物、理化以及生化特性是表征大曲品質的重要指標[5-6]。目前，對食醋大曲特性的研究主要針對其發酵過程中微生物菌系、關鍵理化指標以及風味物質等內容。王佳麗[7]采用Illumina Miseq高通量測序技術對山西老陳醋大曲發酵過程中的微生物群落多樣性及其與基礎理化指標、風味物質的關系進行了研究，發現芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、泛菌屬、假絲酵母屬、曲霉屬等為大曲優勢菌，相關性分析表明，乳桿菌屬、片球菌屬、假絲酵母屬、威克漢姆酵母屬與水分、總酸、還原糖含量呈正相關，芽孢桿菌屬、泛菌屬、曲霉屬與室溫及曲心溫度呈正相關，同時微生物群落對大曲制備過程中有機酸、揮發性風味物質的形成具有重要作用。NIE等[8]采用PCR-DGGE技術對天津獨流醋大曲的微生物群落結構進行了探究，發現Bacillus,Streptomycescacaoi,Streptomycesalbus,Lactococcusgarvieae,Weissellaconfuse為主要優勢細菌，Aspergillusniger,Saccharomycopsisfibuligera,Pichiakudriavzevii為大曲優勢真菌。GAN等[9]通過對岐山醋曲3個發酵階段中細菌菌群與理化指標進行相關性分析，揭示了環境因子是各發酵階段微生物差異性的影響因素，說明在大曲發酵過程中，菌群與環境因子、物料相互作用，共同制約大曲發酵過程中關鍵指標的演替。此外，ZHENG等[10]采用傳統可培養與分子生物學的方法，探究了汾酒大曲中優勢菌群的動態變化，表明不同種類的微生物群體在不同發酵階段占主導地位，pH值、水分、酸度以及溫度是影響微生物演替的重要環境因子。因此，監測大曲發酵過程中的指標，可為大曲質量的評價、規范大曲生產工藝提供理論依據。

為系統揭示保寧醋中藥醋曲固態發酵過程中關鍵微生物數量與理化性質的動態變化，分析大曲中可培養微生物與環境因子間的互作關系，本試驗以保寧醋中藥醋曲為研究對象，對其發酵過程中微生物及理化性質的動態變化以及不同醅層間的差異進行分析，初步闡明大曲中理化指標對微生物數量的影響及對關鍵生化指標的影響，為保寧醋中藥醋曲品質的評價及制曲工藝的改良提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品來源

保寧醋“中藥醋曲”，采集自四川保寧醋有限公司制曲車間(四川 閬中)。

1.1.2 培養基及試劑

平板計數瓊脂(g/L)：胰蛋白胨5、酵母浸粉2.5、葡萄糖1、瓊脂粉15。

LB固體培養基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸粉5、NaCl 10、瓊脂粉20。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(含氯霉素)(g/L)：馬鈴薯浸出粉6、葡萄糖20、氯霉素0.1、瓊脂粉20。

NaOH、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞、鹽酸、KI、碘等試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器與設備

1300 Series A2生物安全柜，美國Thermo Fisher Scientific公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋、DHG-9126電熱恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司；TE412-L精密電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集

采樣時間：2019年1～2月。

五點采樣法采集中藥醋曲發酵第1、3、5、7、9、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50 天的樣品，每一發酵時間采集3份平行樣品，并在無菌條件下將各大曲樣品切分為曲表樣品(距曲塊邊緣0～4 cm處)與曲心樣品(除曲表樣品剩余部分)，分別粉碎后收集至無菌均質袋中，進行實驗室分析。

1.2.2 理化指標分析

1.2.2.1 大曲溫度的測定

溫度的監測包括曲房溫度和曲塊醅溫，曲房溫度由曲房內的溫濕表測定，醅溫測定是將溫度計插入曲塊中心(10 cm左右)的方式進行測量。

1.2.2.2 pH值測定

參照 GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》[11]。準確稱取大曲樣品10 g于無菌均質袋中，精確至0.01 g，再加入100 mL超純水，均質后浸泡30 min，再次混勻后用校準好的pH計直接測量。每份樣品重復測定3次。

1.2.2.3 水分的測定

采用水分快速測定儀直接測定。每份樣品重復測定3次。

1.2.2.4 淀粉與還原糖含量的測定

參照GB 5009.9—2016《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》[12]測定淀粉的含量。

參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》[13]測定還原糖的含量。每份樣品重復測定3次。

1.2.3 微生物指標計數

1.2.3.1 菌落總數計數

無菌條件下稱取25 g 樣品，加入225 mL無菌生理鹽水，充分均質混勻后，參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[14]方法，進行菌落總數的計數，每一稀釋度做2個平行，同時吸取1 mL無菌生理鹽水于無菌平皿內作空白對照。

1.2.3.2 霉菌及酵母菌計數

參照GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母菌計數》[15]方法，于28 ℃下培養2～3 d，每隔12 h計數1次，并記錄最終霉菌和酵母菌總數的計數結果。同時吸取1 mL無菌生理鹽水于無菌平皿內作空白對照。

1.2.3.3 芽孢桿菌計數

在上述梯度稀釋后的樣液中，選擇3個適宜稀釋梯度的樣品勻液，將其置于85 ℃水浴鍋中保溫30 min，冷卻后取樣液參照菌落總數計數方法，于37 ℃下培養2 d，計數，同時吸取1 mL無菌生理鹽水于無菌平皿內作空白對照。

1.2.4 關鍵生化指標的測定

糖化力、液化力、酯化力的測定方法均參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[16]，每份樣品重復測定3次。

1.3 數據處理及分析

通過GraphPad Prism 8軟件進行數據簡單處理及繪圖，采用SPSS 25軟件進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，并計算Spearman相關性系數。

2 結果與分析

2.1 中藥醋曲發酵過程中理化指標的動態分析

2.1.1 曲醅溫度

由圖1可知，在整個發酵過程中最高醅溫55 ℃，因此判斷保寧醋中藥醋曲為中溫型大曲[17]。根據溫度變化情況，結合固態發酵過程的溫度變化特點，將保寧醋中藥醋曲的整個發酵過程劃分為3個時期、7個階段。3個時期分別為發酵前期(1～5 d)，發酵中期(5～11 d)，發酵后期(11～50 d)；7個階段時間為臥曲(0～1 d)、上霉(1～3 d)、晾霉(3～5 d)、潮火(5～9 d)、大火(9～13 d)、后火(13～25 d)和養曲(25～50 d)。

圖1 中藥醋曲不同醅層發酵過程中溫度的動態變化Fig.1 The dynamic changes of temperature of different layers in the fermentation process of herb Daqu starter

2.1.2 曲醅基礎理化指標的動態變化

中藥醋曲發酵過程中pH值的測定結果如圖2-a所示，在發酵前期，曲表和曲心的pH值均呈下降趨勢，均于第7天達到最低值，最低值分別為5.15和4.60，推測可能是由于部分產酸菌的繁殖，pH值在發酵中期出現回升并一直持續到發酵后期均在7.00附近波動，在發酵結束時(第50 天)，曲表和曲心的pH值分別為7.00和7.47；中藥醋曲在發酵中、后期pH值在中性附近波動變化，是醋曲微生物菌群演替的作用結果，同時也避免了中藥醋曲的酸化，對成品曲的品質具有一定的積極作用。對不同醅層的pH值對比分析，除第1 天外，其余發酵時間的pH值均呈顯著性差異(P<0.05)。

中藥醋曲發酵過程中水分含量的動態變化如圖2-b所示。在整個發酵過程中，水分含量呈整體下降的趨勢，且由于發酵前期、中期醅溫上升較快，導致水分下降速度較快，發酵后期水分含量隨溫度的降低而維持在較低水平。曲表和曲心樣品均于第35 天達到最低值，分別為13.03%和16.50%。在達到最低值后，水分含量有些許回升，可能是因為樣品之間的差異性或醋曲樣品水分低于環境濕度，導致樣品吸濕。在發酵結束時(第50 天)，曲表和曲心的水分含量分別為13.46%和16.78%，對比分析不同醅層樣品的水分含量可知，除第1天與第3天外，其余發酵時間曲表樣品的水分含量顯著高于曲心(P<0.05)。

中藥醋曲發酵過程中淀粉含量的監測結果如圖2-c所示，在整個發酵過程中淀粉含量均在70 g/100g左右波動，可能在這個過程中微生物代謝產生淀粉酶對淀粉的降解作用與其代謝產生的纖維素酶降解原料中的纖維素，釋放被纖維細胞結構中包裹的淀粉顆粒的作用處于動態的平衡之中[18-19]。在發酵結束時(第50 天)，曲表和曲心淀粉含量分別為61.80和68.48 g/100g，整個發酵過程的高淀粉含量也佐證了大曲的投糧作用[20]。對不同醅層樣品淀粉含量的差異性進行分析可知，除第3、30 天外，樣品差異不顯著。

保寧醋中藥醋曲發酵過程中還原糖含量的動態變化如圖2-d所示，在發酵前期，還原糖含量呈波動變化，但整體呈下降趨勢。一方面微生物在發酵前期利用還原糖大量生長繁殖，另一方面微生物產生淀粉酶將淀粉轉化為還原糖[20]。在發酵中、后期還原糖含量有所回升后呈下降的波動趨勢，可能是由于微生物代謝分解原料中的淀粉、纖維素與利用還原糖處于動態變化中。在發酵結束時(第50 天)，曲表和曲心的還原糖含量分別為3.34和1.78 g/100g。對比不同醅層樣品的還原糖含量可知，除第9、11、13、25、30天外，曲心的還原糖含量均顯著低于曲表樣品(P<0.05)。

2.2 大曲發酵過程中的關鍵微生物類群數量分析

大曲中微生物種類豐富，是食醋發酵中功能菌種的來源之一。對大曲發酵過程中菌落總數的計數結果如圖3-a所示，在整個發酵過程中，由于環境及原料中的微生物富集，且發酵前期曲塊溫度、水分等條件適宜，微生物得以利用原料中的營養物質迅速生長繁殖，曲表和曲心分別于第7、9 天達到峰值(菌落總數lg值分別為9.9和9.0 CFU/g)；達峰值之后，大曲經潮火和大火階段，溫度達到55 ℃，許多微生物在該溫度下生長會受到抑制甚至死亡，菌落總數降低，并在此后呈波動變化；在發酵后期，因某些耐低水分含量的微生物的生長繁殖導致菌落總數呈現稍稍回升的趨勢，但此后可能由于水分含量再次降低，低水分的環境脅迫致使微生物含量再次下降，在發酵結束時(第50 天)，曲表和曲心菌落總數的lg值分別為9.3和7.0 CFU/g，相對較高的微生物量佐證了中藥醋曲具有為食醋發酵提供菌源的作用。對不同醅層的菌落總數進行對比分析，相較于曲表而言，曲心菌落總數到達峰值時間略微延遲，推測可能是曲表的環境條件(如氧氣濃度、溫度、水分含量等)更適宜微生物的生長，微生物生長繁殖較快所致。除第1、3、9 天外，在其余發酵時間曲表菌落總數均顯著高于曲心，這可能是由于曲心是一個相對厭氧的環境且曲心的溫度高于曲表，不利于曲塊中部分微生物的生長[21]。

a-pH值；b-水分含量；c-淀粉含量；d-還原糖含量圖2 中藥醋曲不同醅層在發酵過程中基礎理化指標的動態變化Fig.2 The dynamic changes of basic physicochemical indexes of different layers in the fermentation process of herb Daqu starter

中藥醋曲發酵過程中霉菌及酵母菌的計數結果與菌落總數的結果類似，如圖3-b所示。在整個發酵過程中，發酵前期微生物利用原料中的營養物質迅速生長繁殖，曲表和曲心分別于第7、9 天達到峰值(菌落總數lg值分別為8.4和8.0 CFU/g)；隨著溫度的升高及水分含量的降低，霉菌及酵母菌在高溫環境下生長受到抑制甚至死亡，數量明顯降低；在發酵后期，霉菌及酵母菌數量呈波動變化。在發酵結束時(第50天)，曲表和曲心菌落總數的lg值分別為7.2和6.6 CFU/g，說明大曲微生態環境中的霉菌和酵母菌不斷被低水分含量這一環境因子進行馴化。對不同醅層的霉菌及酵母菌進行對比分析可知，曲表菌落總數到達峰值時間比曲心晚。除第1、3、9 天外，在其余發酵時間曲表霉菌及酵母菌數量均明顯高于曲心，這可能是因為曲心是一個相對厭氧的環境且曲心的溫度高于曲表，不利于曲塊中霉菌及酵母菌的生長[21]。

由芽孢桿菌的計數結果(圖3-c)可知，發酵前期芽孢桿菌在波動變化中呈上升趨勢，曲表和曲心分別于第7、20天達到峰值(菌落總數lg值分別為7.3和7.2 CFU/g)。達峰值后經潮火和大火階段，溫度達到55 ℃，部分芽孢桿菌在該溫度下生長會受到抑制甚至其未形成芽孢的細胞出現死亡現象，導致芽孢桿菌數量明顯降低，并在此后呈波動變化。在發酵后期，芽孢桿菌數量出現回升的趨勢，但此后可能由于水分含量降低，該環境脅迫因子致使微生物含量再次下降，在發酵結束時(第50天)，曲表和曲心菌落總數的lg值分別為8.3和7.0 CFU/g，芽孢桿菌數量相對較高，能為后續食醋發酵提供菌源。對不同醅層的芽孢桿菌進行對比分析可知，曲心芽孢桿菌數到達峰值時間晚于曲表，這可能是曲表的環境條件(如氧氣濃度、溫度、水分含量等)更適宜芽孢桿菌的生長，芽孢桿菌生長繁殖較快所致。同時，由于曲心溫度較高且相對厭氧，因此除第20、35 天外，其余發酵時間曲表芽孢桿菌數量均高于曲心[21]。

2.3 中藥醋曲發酵過程中關鍵生化指標的動態分析

對中藥醋曲發酵過程中糖化力的監測結果如圖4-a所示，在發酵前期，曲表的糖化力整體呈上升趨勢，并在第7 天達到峰值[1 245 mg/(g·h)]。達到峰值后，由于溫度升高導致部分糖化菌數量減少，糖化力降低；在發酵后期，糖化力回升后呈現平穩變化，在發酵的最后階段，可能因為水分含量的降低引起微生物代謝產糖化酶活力降低，糖化力進一步下降，在發酵結束時(第50 天)，糖化力值為1 017 mg/ (g·h)。曲心樣品的糖化力整體呈下降趨勢，在發酵開始時(第1 天)糖化力為1 432.38 mg/(g·h)，可能是由于原料的內源性酶帶入所致；在發酵中期，經潮火和大火之后，糖化力顯著降低；在發酵后期，糖化力處于平緩的變化趨勢，在第35 天稍有回升，可能是因為部分抗逆性強的微生物適應環境條件后生長代謝所致，之后可能由于水分含量的降低引起微生物死亡，從而導致糖化力再次下降，在發酵第50天，糖化力大小降為107.11 mg/(g·h)。對比分析不同醅層樣品的糖化力水平，除第1、3、5 天外，曲心的糖化力均顯著低于曲表(P<0.05)。

a-菌落總數；b-霉菌與酵母菌總數；c-芽孢桿菌數圖3 中藥醋曲不同醅層在發酵過程中關鍵微生物數量的動態變化Fig.3 The dynamic changes of microbial quantity of different layers in the fermentation process of herb Daqu starter

保寧醋中藥醋曲發酵過程中液化力的測定結果如圖4-b所示，發酵前期，曲表和曲心的液化力均處于極低的水平；第7 天之后，曲表和曲心的液化力急劇上升，并在發酵中、后期呈波動變化，但整體呈上升趨勢，可能是因為在中后期產淀粉酶的霉菌和芽孢桿菌處于一個較高的數量級或是產淀粉酶活力較高；在發酵末期，液化力下降，可能由于水分含量的降低，導致微生物數量級降低，以致液化力降低。在發酵結束時(第50 天)，曲表和曲心的液化力分別為1.26和0.40 g/(g·h)。對比分析不同醅層樣品的液化力可知，除第1、3、5 天外，曲心的液化力均顯著低于曲表(P<0.05)。

保寧醋中藥醋曲發酵過程中酯化力的動態變化如圖4-c所示，在發酵前期，曲表和曲心的酯化力處于較低的水平，隨后顯著升高(P<0.05)，冬季曲表和曲心均于第13天達到最大值，分別為1 442.49 和1 709.12 mg/(50g·7d)；在發酵中期，因經歷潮火和大火階段，溫度較高導致微生物數量級降低從而導致酯化力下降；在發酵后期由于微生物處于消長變化的動態過程之中，酯化力也在該過程中不斷變化，在發酵結束時(第50天)，曲表和曲心的酯化力分別為1 273.09和1 152.85 mg/(50g·7d)。對比分析曲表與曲心樣品的酯化力可知，除1、5、9、13 d外，曲心的酯化力均顯著低于曲表(P<0.05)。

a-糖化力；b-液化力；c-酯化力圖4 中藥醋曲不同醅層在發酵過程中關鍵生化指標的動態變化Fig.4 The dynamic changes of key biochemical properties of different layers in the fermentation process of herb Daqu starter

2.4 保寧醋中藥醋曲微生物數量和理化指標變化的相關性分析

對中藥醋曲微生物數量與理化指標基于Spearman相關性系數的分析可知(圖5)，溫度是影響菌落總數和霉菌及酵母菌總數的重要環境因子，而影響芽孢桿菌數變化的因子主要為水分含量，此外，菌落總數、霉菌與酵母菌總數與糖化力水平強相關，芽孢桿菌數量則與液化力水平強相關。中藥醋曲固態發酵過程中，微生物菌群與各項理化指標相互關聯。環境因子的變化及差異會影響微生物類群數量的變化及差異，從而對其他理化指標以及酶活性產生影響。

圖5 醋曲中微生物數量與理化指標的相關性熱圖Fig.5 Correlation heatmap of the microbial quantity and physicochemical properties of herb Daqu starter

3 討論

目前食醋大曲仍沿用開放式發酵的傳統生產模式，其品質易受環境影響，加之對大曲發酵過程中理化指標、微生物與酶系的動態變化研究甚少，從而導致在生產工藝優化及品質評價方面缺乏基礎數據。本試驗分析了中藥醋曲整個發酵過程不同醅層關鍵微生物類群數量以及理化性質的動態變化及差異，并初步探究導致變化及差異的原因。微生物平板計數表明，曲表高于曲心，這一結果與LI等[18]的研究結果一致，霉菌和酵母菌總數低于岐山醋大曲；保寧醋中藥醋曲為中溫型大曲，其溫度變化符合固態發酵過程的特點[17]；在整個發酵過程中醋曲理化指標呈波動變化，在發酵結束時，水分含量與糖化力均高于岐山醋大曲[18, 22]。不同醅層間的微生物與理化指標有明顯差異。溫度和水分含量是影響中藥醋曲微生物數量呈動態變化的主導環境因子。發酵前期，溫度與pH值較為適宜，微生物數量呈逐漸上升的趨勢；發酵中期，由于醅溫的升高以及水分含量的降低，微生物數量整體下降，但部分芽孢桿菌繼續生長，產生相關酶類，其中糖化酶因不耐高溫，活力逐漸降低；在發酵后期，由于環境因子處于動態穩定，微生物數量變化趨于平穩。不同醅層之間的溫度、水分含量以及溶氧量的差異導致了微生物數量的變化，從而導致生化指標的差異，說明了大曲固態發酵過程是其向具有耐熱、抗低水分等特性的微生物群落演變的過程[23]。

食醋大曲發酵體系中的微生物菌群復雜、存在不可培養類群，因此，采用傳統微生物培養的手段對其發酵過程中的微生物進行動態解析具有一定的局限性，且本研究尚未對部分特定的功能微生物進行計數分析。今后的研究可在現有研究的基礎上結合高通量測序技術和特定微生物的傳統培養技術進行微生物菌群解析，同時對發酵過程中大曲的風味物質演替進行監測與分析，更為全面地詮釋在食醋大曲固態發酵過程中微生物群落動態變化的原因及其可能產生的影響，為食醋大曲的品質改良提供基礎數據。