腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦黑變及品質劣變的影響

林婷，楊勝平,2，郁佳怡，謝晶,2，錢韻芳,2*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)，又名凡納濱對蝦，其富含的蝦青素具有抗氧化、抑制炎癥及調節免疫活性等多種生物功能，因此深受消費者歡迎。腐敗希瓦氏菌在南美白對蝦貯藏過程中代謝產生異臭味物質，導致其腐敗變質[1]。黑變是導致蝦類水產品品質劣變的另一重要原因，且黑變速率往往早于微生物腐敗[2-3]。雖然黑色素的產生并不會造成食用安全性問題，但增加了消費者感官上的不可接受性[4]。現有研究普遍認為，黑變的發生主要是在蝦內源性多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)催化下酪氨酸氧化成L-3,4-二羥基苯丙氨酸(3,4-dihydroxyphenylL-alanine，L-DOPA)，而后轉變成醌類物質[5]，從而進一步氧化成深棕色黑色素或參與蛋白質官能團的聚合反應，形成交聯聚合物，呈現為深色的黑色素[6]，而不是由微生物代謝產生的，但其激活過程可能與微生物有關[7]。

為了解微生物在蝦類黑變過程中的作用，本研究將腐敗希瓦氏菌接種于經滅菌處理的南美白對蝦上，分析南美白對蝦在貯藏過程中的品質和理化指標的變化，探究腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦黑變及品質劣變的影響，以期為揭示南美白對蝦品質劣變的原因提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

腐敗希瓦氏菌(ShewanellaputrefaciensQY38，NCBI號：KX692894)，課題組前期從腐敗南美白對蝦中分離、篩選并鑒定，并在-80 ℃下保存菌株。

南美白對蝦購于上海市浦東新區蘆潮港海鮮市場，用碎冰使其休克失活，并用雙蒸水清洗2次。

1.2 試驗試劑

4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol，4-HR)，上海阿拉丁試劑公司；Proclin-300、PPO活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；磷酸鹽緩沖液、氯化鈉、氫氧化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；鐵瓊脂培養基，青島海博生物技術有限公司。

1.3 儀器與設備

TA.XT Plus質構儀，英國Stable Micro System公司；CR-400型色差計，日本Konica Minolta公司；Kjeltec 2300型凱氏定氮儀，瑞士FOSS公司；超凈工作臺，上海康福特環境科技有限公司；XB220A-SCS分析天平，北京普利賽斯科技有限公司；H-2050R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計，美國尤尼柯儀器有限公司；LDZM-40KCS-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療機械廠；LHS-100CL型恒溫恒濕箱，上海一恒科學儀器有限公司；MR23-060H-I型低場核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化

參考YANG等[8]的方法，腐敗希瓦氏菌QY38菌株實驗前進行活化處理：30 ℃水浴解凍凍存的腐敗希瓦氏菌菌液，取1 mL至滅菌的9 mL腦心浸肉湯中30 ℃、150 r/min活化18 h，取活化菌液1 mL至9 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養基中，30 ℃、150 r/min培養8 h，得到在對數期的腐敗希瓦氏菌菌液(108CFU/mL)，使用前用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL。

1.4.2 樣品預處理

將鮮活的南美白對蝦用碎冰低溫致死，挑選無損傷且質量在16～18 g的蝦若干，先經過0.05% Proclin-300浸泡10 min滅菌處理，然后用無菌水沖洗3遍，之后隨機分為3組。以未接菌為對照組(A組)，接種腐敗希瓦氏菌為B組及以0.15 mg/mL 4-HR浸泡5 min并接種腐敗希瓦氏菌的組別為C組。在無菌密封袋中，4 ℃冰箱貯藏，各指標測定1次/d。

1.4.3 感官評分

依據對蝦的衛生標準并參考趙海鵬等[9]的方法，對南美白對蝦從肌肉組織、外觀和氣味等方面進行評分。

1.4.4 色差值

根據QIAN等[10]的方法稍做修改，用白色校準板校準色差計后，測定南美白對蝦頭和第二腹節的L*、a*、b*的值，每個平行樣品測定3次，取平均值。

根據公式(1)計算總白度值[11]，平行測定3次。

白度值=100-[(100-L*)2+a*2+b*2]0.5

(1)

式中：L*值為亮度，黑白差值；a*值為紅綠差值；b*值為黃藍差值。

1.4.5 質構特性的測定

根據藍蔚青等[12]的方法稍做修改，對南美白對蝦第二腹節肌肉置于測試面中心進行質地多面分析(texture profile analysis，TPA)。測試條件為：平底柱形探頭P50、測前速率3.00 mm/s、測試速率1.00 mm/s、測后速率1.00 mm/s、壓縮變形率30%，每個樣品測試6次，取平均值。

1.4.6 揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)測定

參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》，利用自動凱氏定氮儀平行測定各組樣品貯藏期間的TVB-N值，每組5 g樣品做3個平行，取平均值，結果以mg/100g表示。

1.4.7 PPO活性

參照試劑盒說明書進行操作，以1 min 1 g組織在1 mL反應體系中使410 nm處吸光度變化的值表示酶活力。

1.4.8 菌落總數(total viable count，TVC)測定

在超凈臺上操作，稱取25.00 g蝦肉于225 mL無菌生理鹽水中混合，參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》中的方法用鐵瓊脂培養基測定蝦的菌落數。每個稀釋度作2次平行，以滅菌的稀釋度作為空白對照試驗，結果以lgCFU/g表示。

1.4.9 低場核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)分析

將整只帶殼南美白對蝦用保鮮膜包裹，放入核磁檢測管中。參考張楠楠等[13]的方法設置參數，通過對序列指數衰減曲線圖經分析軟件進行批量反演，得到樣品在不同時期的橫向弛豫時間T2譜圖。

1.4.10 核磁共振成像技術(magnetic resonance imaging，MRI)分析

采用MRI技術測定樣品的質子密度圖譜，將帶殼南美白對蝦包上保鮮膜后直接放入直徑70 mm的核磁管中，隨后在低場核磁共振成像儀中予以成像分析。

1.4.11 肌漿蛋白組成測定

參考NIAMNUY等[14]的方法，取蝦肉5 g，加入10倍體積預冷的緩沖液A(15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5)均質，4 ℃下10 000 r/min 離心15 min，再在沉淀中加入10倍體積緩沖液A，重復上述操作2次，將3次離心后的上清液合并，即為肌漿蛋白提取液。

將不同待測樣品溶液與2倍上樣緩沖液等體積混合，沸水浴5 min。采用12%分離膠和5%濃縮膠制膠，使用80 V進行SDS-PAGE，待樣品進入分離膠時電壓調至100 V，直至電泳結束，進行考馬斯亮藍染色液染色，使用脫色液脫色至蛋白質條帶清晰。

1.5 數據處理

試驗數據采用重復試驗平均值，以“平均值±標準偏差”表示。通過SPSS 17.0軟件進行顯著性差異分析，采用Origin 8.5軟件進行繪圖，組間分析采用t檢驗，顯著性界值以P<0.01為極顯著，P<0.05為顯著，P>0.05為不顯著。

2 結果與分析

2.1 接種腐敗希瓦氏菌的南美白對蝦微生物生長情況

4 ℃條件下不同處理方式的南美白對蝦微生物變化情況如圖1所示。A組初始菌落數為3.44 lgCFU/g，而新鮮南美白對蝦的初始菌落總數一般為4.28 lgCFU/g[15]，說明Proclin-300處理能夠減菌90%左右，且在貯藏過程中始終與接菌組保持2 lgCFU/g左右的差值。B、C接菌組的初始菌落總數為6.11 lgCFU/g和6.27 lgCFU/g,比對照組至少高2.67 lgCFU/g，說明背景雜菌在接種腐敗希瓦氏菌的群落中占比較小。在貯藏過程中，3組樣品的菌落總數、嗜冷菌和產H2S菌的菌落數均呈上升趨勢，且2組接菌組微生物數量相近。接菌組中產H2S菌數量與菌落總數和嗜冷菌接近，而腐敗希瓦氏菌屬于產H2S菌[16]，說明接菌組中能產H2S的腐敗希瓦氏菌占主導地位，對蝦可能產生的腐敗影響主要由腐敗希瓦氏菌產生。

a-總菌；b-嗜冷微生物；c-產H2S菌圖1 不同處理方式南美白對蝦微生物的變化圖Fig.1 Changes in microorganism of shrimps in different treatment groups

2.2 接種腐敗希瓦氏菌的南美白對蝦感官評分

南美白對蝦的感官評分主要由肌肉組織、外觀和氣味3部分組成，其變化如圖2所示。4 ℃條件下未接菌的A組在Proclin-300的作用下微生物生長較緩，雖然肉質、氣味、脫殼松軟度方面較接菌組好，但在貯藏2 d后就出現了黑變現象，說明Proclin-300不能抑制黑變；B組為添加了Proclin-300的接菌組，不僅發生了嚴重的黑變，且在腐敗希瓦氏菌的作用下出現汁液流失、散發強烈的氨臭味和硫臭味、蝦殼變軟等品質劣變現象，感官評分最低；C組為添加了4-HR的接菌組，該組別在4-HR的作用下顯著延緩南美白對蝦黑變，蝦身呈現灰白色不透明狀，因黑變程度低，其感官總體評分仍高于其他2個組別，進一步證實4-HR是一種有效的抑黑變保鮮劑[4]。

2.3 接種腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦PPO活性的影響

PPO大部分分布于對蝦血液里、頭胸部和關節處等，是其免疫應答系統的重要組成部分[17]，也是多酚氧化酶原激活系統(propolyphenol oxidase activating system，proPPO-AS)級聯反應鏈中的關鍵酶，是黑色素形成的限速條件[18]。圖3為不同處理組對蝦PPO活性的變化情況。

圖2 不同處理方式南美白對蝦的感官評分變化Fig.2 Changes of sensory score of shrimps in different treatment groups

圖3 不同處理組對蝦PPO活性的變化Fig.3 Changes of PPO activity of shrimps in different treatment groups

從3圖中可以看出，3組樣品中A組的PPO活性初始值最高，為7.92 U/g，而C組PPO活性僅為 0.12 U/g，這與4-HR對蝦中PPO活性抑制作用有關，而Procline-300抑菌處理對PPO活性無顯著影響。研究表明Procline-300是一種微生物抑制劑，但對酶活性的影響較小[19]。A組PPO活性呈現先下降后上升的趨勢，可能與初始微生物數量較低，其后緩慢增加的變化趨勢有關。有研究表明微生物多糖如幾丁質，β-葡聚糖，脂多糖和脂蛋白酸等免疫調節性碳水化合物可以激活proPPO-AS系統[20]，在對蝦血淋巴中通過一系列級聯反應將無活性的多酚氧化酶原(propolyphenol oxidase，proPPO)轉化為有活性的PPO[21]。B組的初始PPO活性為3.84 U/g，第3天后快速升高，第5天時達到7.08 U/g，且已超過A組，說明接種腐敗希瓦氏菌能夠促進PPO活性的升高。C組PPO活性在初始階段因受到4-HR的抑制而明顯偏低，但在貯藏過程中呈現逐漸上升的趨勢，這可能與接菌后PPO在微生物和內源酶的作用下不斷被激活釋放有關，但整體水平始終低于B組和A組。

2.4 接種腐敗希瓦氏菌的南美白對蝦色差值變化

南美白對蝦在貯藏和加工過程中，體表會出現黑斑，是多酚氧化酶催化酪氨酸氧化等一系列反應產生的黑色素[22]。由圖4-a和圖4-b可知，隨著貯藏時間的延長，4-HR抑酶組白度值始終高于未抑酶組，說明抑制PPO活性能夠顯著延緩南美白對蝦的黑變。而同樣經過Proclin-300處理的接菌組白度值低于未接菌組，可能是由于腐敗希瓦氏菌的細胞壁能激活酪氨酸酶原，進而影響黑變的反應速度[23]。

新鮮蝦體因蝦青素與蛋白質復合而呈綠或藍色，但在貯藏過程中其蛋白質-色素復合體被分解，導致色素游離使體表變紅[24]，通常由a*值表示蝦體紅變情況。由圖4-c和圖4-d可知，隨著貯藏時間的延長，樣品a*值持續增加。由于南美白對蝦頭部含有內臟等不透明的有色物質，頭部較蝦體較早開始變紅，且接菌組始終高于未接菌組，說明腐敗希瓦氏菌促進蛋白質的降解進而促進蝦體內的蝦青素或蝦青素酯的釋放。而蝦身樣品色澤相對透明，各組別a*值雖持續上升但顯著性差異不明顯，僅最后1 d的接菌組顯著高于未接菌組。

a、c-蝦頭；b、d-蝦身圖4 不同處理組的白度值和a*值的變化Fig.4 Changes in variance of lightness and redness (a*) in different treatment groups

2.5 接種腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦TVB-N含量的影響

TVB-N含量常用于評價水產品腐敗程度，通過反映水產品中蛋白質在微生物和酶的共同作用下，分解而產生的三甲胺、二甲胺、氨和其他胺類等堿性含氮物生成量[12, 25]。由圖5可知，3組樣品TVB-N值含量在貯藏初期分別為5.49、7.78、9.38 mg/100g，接菌組樣品的TVB-N值略高，這可能與接種腐敗希瓦氏菌的浸泡處理有關。隨著貯藏時間的延長，3組樣品的TVB-N含量整體呈上升趨勢，B和C兩組接菌組在貯藏前2 d TVB-N含量相近，且略高于未接菌組，表明TVB-N含量的上升與腐敗希瓦氏菌生長代謝活動有關。貯藏3 d后，C組TVB-N值整體水平明顯高于A組和B組，且組別間差異逐漸增大，這可能與該組別中在4-HR的作用下黑色素生成減少有關。有研究表明黑色素物質具有抑制腐敗菌生長的作用[26]，而本研究表明黑色素物質的作用可能更多表現在抑制腐敗菌的致腐能力。

圖5 不同處理組對蝦TVB-N值的變化Fig.5 Changes in TVB-N value of shrimps in different treatment groups

2.6 接種腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦質構特性的影響

蝦類等水產品在微生物與內源酶的作用下，其肌肉組織與質構特性發生相應變化，最終導致肌體軟化、彈性和食用口感下降，其中彈性反映食品恢復形狀的能力，可部分反映食物的口感[12]。如圖6所示，隨著南美白對蝦貯藏時間的延長，各組硬度、彈性均呈下降趨勢。貯藏至第3天時，B組樣品的硬度降至6 536.80 g，A、C組在第3天的時候分別為6 475.26和6 690.36 g；同時，樣品的彈性由初期0.91、0.90、0.92在貯藏末期分別降至0.85、0.80、0.69，彈性損失率分別為7.02%、11.57%、24.14%。在整個貯藏期間，A組樣品的硬度略高于B、C組，但B、C組差異不明顯。如圖6-b所示，隨著貯藏時間的延長，咀嚼性下降幅度增加，第5天時咀嚼性分別降低 53.94%、54.49%、54.57%，且在貯藏過程中，A、B組樣品的咀嚼性下降速度緩于C組。由質構結果的組間差異顯著性分析，肌肉硬度、肌肉細胞間凝聚力與彈性下降會造成樣品的咀嚼性降低(P>0.01)。這可能表明接種腐敗希瓦氏菌會加速南美白對蝦肌肉蛋白的腐敗，最終導致硬度和彈性的下降。C組的硬度和彈性在貯藏中后期出現明顯的下降，與TVB-N的變化呈負相關，說明C組蝦肉蛋白在貯藏中后期發生了更嚴重的降解劣變。

a-硬度；b-彈性圖6 不同處理組對蝦硬度和彈性的變化Fig.6 Changes of polyphenol oxidase activity of shrimps in different treatment groups

2.7 接種腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦核磁共振與成像的影響

MRI通過呈現二維的質子密度圖，能夠直觀地檢測到肌體內水分的空間分布狀態。樣品不同區域的信號強度與水分子含量成正比，一般來說，圖像中顏色越亮，代表此區域的水質子信號越強，表明蝦仁體內的水分含量就越高[12]。如圖7所示，相較于新鮮樣品，處理后蝦頭部水分含量有所下降，蝦質子密度圖整體色澤仍呈紅色，主要集中在蝦頭。隨著貯藏時間的延長，3組南美白對蝦蝦肉中質子密度加權像偽彩圖的亮度逐漸減弱，在3 d后開始蝦身呈現與底色相近的藍色，蝦頭部的紅色區域也逐漸變小、變黃，表明水分逐漸流失，說明品質發生嚴重的劣變。LF-NMR的橫向弛豫時間圖譜上有3個峰，分別是T21(0.1～4.0 ms)、T22(10～86 ms)、T23(200～900 ms)[12]。在整個貯藏期間，隨著貯藏時間的延長，3組樣品T22振幅均明顯降低，說明在對蝦中自由水移動性逐漸增強，即蝦肉持水性降低。其中未接種腐敗希瓦氏菌的組別蝦肉中非水組分物質結合更牢固，表明腐敗希瓦氏菌影響南美白對蝦的腐敗，破壞其肌肉結構，導致束縛水向自由水轉變，肌肉中水分流失。

a-1H-MRI圖；b-信號強度圖圖7 不同處理組對蝦的1H-MRI圖和信號強度圖Fig.7 Pseudo color of 1H-MRI and signal intensity for shrimps in different treatment groups注：X-鮮樣；A-Proclin-300處理；B-Proclin-300+ 腐敗希瓦氏菌處理；C-4-HR處理；0～5分別表示貯藏0～5 d

2.8 接種腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦肌漿蛋白的影響

水產品肌肉蛋白質可以分為細胞內蛋白質(肌原纖維蛋白、肌漿蛋白)和細胞外蛋白質(堿溶性蛋白和肌基質蛋白)，其中肌漿蛋白是水溶性蛋白的主要成分，其變化可用于指示蝦的鮮度變化[27]。由圖8可知，A組中條帶I(66 kDa)，光密度在貯藏前后變化不明顯，但在B、C組中快速消失，說明腐敗希瓦氏菌會加速條帶I蛋白的分解。3組樣品中條帶II(45 kDa)、III(27～45 kDa)、IV(14.4～27 kDa)光密度在貯藏過程逐漸減弱直至消失，說明這幾種主要的肌漿蛋白也發生了降解，這可能是內源性蛋白酶和細菌蛋白酶共同作用的結果。

圖8 不同處理組對蝦肌漿蛋白的SDS-PAGE結果Fig.8 SDS-PAGE of sarcoplasmic protein for shrimps in different treatment groups

3 結論

本文分別以未接菌組和4-HR處理的接菌組為對照，探究了腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦黑變及品質的影響，發現腐敗希瓦氏菌不僅與蝦肉蛋白的降解、水分流失、硬度和彈性的下降明顯相關，且具有促進PPO活性和對蝦黑變的作用，該作用機理可能與PPO原激活系統有關，因此其生長變化應受到關注和抑制。4-HR作為蝦類保鮮劑僅能通過抑制PPO酶活性發揮防黑變作用，而對微生物引起的腐敗變質沒有影響，因此在使用過程中需要配合抑菌劑才能達到相對較好的保鮮效果。