葡萄糖亞適量流加對谷氨酸棒桿菌產 L-異亮氨酸的影響

熊海波，劉景陽，徐慶陽,2,

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300457）

L-異亮氨酸屬于分支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一，L-異亮氨酸用途廣泛，是人體激素、蛋白質合成和能量生成的原料，能促進蛋白質合成并抑制其分解[1-4]； 隨著人們對L-異亮氨酸認知越來越全面，其在飼料、食品、醫藥等領域的應用越來越廣泛[5-7]。

產酸率及菌種活力是評價發酵能力的重要指標，因此隨著對L-異亮氨酸的深入研究，具有原料成本低、發酵條件溫和、發酵能力穩定的的谷氨酸棒桿菌發酵法逐漸成為生產L-異亮氨酸的主要方式[8-10]。而發酵能力不僅取決于發酵培養基的選擇，更取決于發酵方法的控制，這包括多尺度發酵過程控制技術、超聲輔助發酵技術、循環發酵技術、半連續發酵技術等。目前L-異亮氨酸發酵方法主要采用低殘糖流加工藝，而這種方法主要面臨糖酸轉化率低、發酵溶氧供應不足、副產物積累過多等問題，進而導致發酵周期縮短以及L-異亮氨酸提取困難[11-12]。

本研究通過分析菌體發酵不同階段對葡萄糖需求能力的不同，采用多階段葡萄糖控制工藝，即將菌體分為適應期、對數生長期、產酸高峰期及衰亡期4 個階段，對菌體攝糖能力的差異進行精準調控，實現菌體的“發酵轉換”[13]，將發酵工藝精細化、合理化，達到發酵產酸的最優條件。這種方法不僅解決菌體適應期長、產酸高峰期短、菌體提前進入衰亡期等問題，還可有效降低能源消耗、提升發酵液質量，為后續的產物提取降低 難度[14]。同時應用代謝流分析原理測定胞外的產物濃度，計算菌體穩定期各途徑的反應速率，得到代謝流量分布，并對流量分配進行對比與分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）YILM1504，由天津科技大學代謝工程實驗室保存。

1.1.2 培養基與試劑

種子培養基配方：葡萄糖30 g/L，豆粕粉10 g/L，酵母粉8 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米漿5 g/L，KH2PO44 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH 0.1 mg/L，賴氨酸1 g/L，蛋氨酸1g/L，谷氨酸1g/L，消泡劑0.2 g/L，用NaOH溶液調節pH 4.5～5.0，種子發酵罐培養用氨水調節并維持pH 6.7～7.0。

發酵培養基配方：葡萄糖60 g/L，MgSO40.8 g/L，KH2PO41.5 g/L，玉米漿5 g/L，VB11 g/L，蛋白胨2 g/L，豆餅水解液10 mL/L，賴氨酸1 g/L，蛋氨酸0.3 g/L，谷氨酸3 g/L，甜菜堿0.3 g/L，用NaOH溶液調節pH 4.5～5.0，發酵罐培養用氨水調節并維持pH 6.7～7.0。

葡萄糖 山東西王藥業公司；玉米漿 內蒙古阜豐生物科技有限公司；其他試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZH-100KBS型全自動立式蒸汽滅菌器 天津博鑫生物科技有限公司；5 L自動控制發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所；1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；KQ-C高壓蒸汽發生器 上海奉賢協新機電廠；752分光光度計 上海分析儀器廠；生物顯微鏡 日本Olympus會社。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養

谷氨酸棒桿菌YILM1504在－80 ℃條件下保存在20%的甘油管中，接種于斜面試管活化24 h，再從斜面取2 環一代活化菌種接種于200 mL茄形瓶固體斜面培養20 h。

5 L種子發酵罐，罐體滅菌后，定容種子菌種培養基2 L，接種，溫度32 ℃，pH值維持在6.7～7.2之間，培養至菌種量OD600nm為20×0.8時接發酵。初始通風 2.0 L/min，初始罐壓小于0.05 MPa，初始轉速200 r/min，罐內溶氧保持在30%～40%之間。一般種子培養時間為

14～16 h。

5 L發酵培養，罐內留800 mL種子液，再接入2.2 L發酵培養基，定容到3 L，進入發酵產酸培養。溫度32 ℃，pH 6.7～7.0，溶氧保持在30%～40%之間，轉速由 200 r/min逐步提加到930 r/min；通風由2.0 L/min逐步提升到6.0 L/min，后根據溶氧變化逐步降低轉速與通風。16 h后測殘糖，流加800 g/L的葡萄糖，維持罐內殘糖在0～20 g/L之間。中間添加適量消泡劑消除泡沫。

1.3.2 分析檢測

1.3.2.1 高效液相色譜法檢測L-異亮氨酸及副產物

發酵液中檢測到除L-異亮氨酸外多種副產物，需要配制多梯度濃度L-異亮氨酸和副產物標準品。發酵液中L-異亮氨酸和副產物濃度用高效液相色譜法測定。采用Agilent C18色譜柱（15 mm×4.6 mm，3.5 μm），衍生劑為2,4-二硝基氟苯，柱前衍生，流動相為50%乙腈、 4.1 g/L乙酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm[15]。

1.3.2.2 pH值的測定

采用pH 6.4～8.0精密pH值試紙測定。

1.3.2.3 葡萄糖含量檢測

每2 h取樣，離心，留上清液。用SBA生物傳感分析儀檢測葡萄糖含量。

1.3.2.4 菌體生物量檢測

每隔2 h取樣，分別稀釋10、20、100、200 倍，用紫外-可見分光光度計測量樣品在600 nm波長處OD值。OD值范圍在0.2～0.8，超過量程后需換下一個稀釋倍數。菌體生物量計算如式（1）所示：

1.3.2.5 pH值在線檢測

發酵罐自帶梅特勒pH值在線檢測，用pH值試劑進行放液驗證檢測。培養基pH值控制可用梅特勒電導率儀精密檢測。

1.3.2.6 溶氧測定

發酵罐自帶瑞士哈美頓VisiFerm DO電極，溶氧校正，0點是飽和亞硫酸鈉溶液中的穩定值，100%點是發酵液滅菌后的冷卻溶液中穩定值。

1.3.3 指標計算

1.3.3.1 糖酸轉化率計算

糖酸轉化率計算[16]如式（2）所示：

式中：ρ為L-異亮氨酸質量濃度/（g/L）；V為發酵液總體積/L；m為總耗糖量/g。

1.3.3.2 最大補糖速率計算

在流加葡萄糖過程中，達到最大補糖速率表現方式是，發酵控制器中溶氧曲線圍繞著某個定值上下波動，其原因是流加葡萄糖隨蠕動泵打入發酵罐內，存在一個蠕動速率（如12/1，表示蠕動泵關12 s，轉動1 s），在蠕動期間，葡萄糖進入罐內，溶氧下降，當停止蠕動，隨著加入的葡萄糖逐漸消耗，溶氧逐漸上升，如此反復，溶氧曲線波動前進。此時葡萄糖對菌體供給平衡，電子天平上補料瓶葡萄糖減少量為期間菌體剛好消耗葡萄糖的量，此時補糖速率為最大補糖速率。再增大補糖速率，也不會增加菌體耗糖速率，多余補充的葡萄糖以罐內殘糖形式存在，甚至會增加發酵液黏稠度與滲透壓，降低菌體活力，減弱葡萄糖吸收能力。通過實時計算不同時期補糖速率，繪制補糖速率曲線。

最大補糖速率計算如式（3）所示：

式中：m1為單位時間耗糖量/g；t為單位補糖時間/h；V1為實時發酵液體積/L。

1.3.4 代謝流網絡建立

采用Vallino等[17]的方法，根據物料平衡計算代謝物的積累速率，如式（4）所示：

式中：xj（t）為第j步反應的反應速率/（mmol/（L·h））；xk（t）為第k步反應的反應速率/（mmol/（L·h））；aj為第j步反應的反應計量系數；ak為第k步反應的反應計量系數；rj（t）為中間代謝物j的積累速 率/（mmol/（L·h））。

由擬穩態假定可得rj（t）＝0。代謝網絡中的m個中間代謝物構成n個代謝流平衡方程式，寫成矩陣形式見式（5）：

式中：A為m×n維矩陣；x（t）為n×1維矩陣；n為選定的速率總數目。待解決問題自由度見式（6）：

建立代謝網絡原則[18]：1）細胞處于非生長時期或細胞濃度變化不大而可以忽略；2）細胞代謝中不存在乙醛酸循環；3）還原型輔酶II（NADPH）供需平衡，即反應途徑中消耗的NADPH與磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，HMP）、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環產生的NADPH總數相等；4）不考慮ATP總量平衡；5）反應過程中無分支節點的反應按一步反應計算。

1.4 數據處理

所有實驗數據取3 次實驗的平均值。單因素方差分析之后Dunnett-t檢驗確定數據差異的顯著性（P＜0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 初始葡萄糖添加量對L-異亮氨酸發酵的影響

2.1.1 初始葡萄糖添加量對菌體生長及L-異亮氨酸產量的影響

分別向發酵培養基中添加30、60、90、120 g/L的初始葡萄糖，以初始葡萄糖添加量30 g/L為對照組，考察初始葡萄糖添加量對菌體生物量及L-異亮氨酸等發酵參數的影響，結果如圖1所示。

圖1 初始葡萄糖添加量對菌體生物量及L-異亮氨酸合成的影響Fig. 1 Effects of different initial glucose concentrations on bacterial biomass and L-isoleucine synthesis

隨著底物葡萄糖添加量的提升，菌體生長速率加快，底物葡萄糖添加量為90 g/L時，菌體生長速率最快，生物量最高，OD600nm達到129，L-異亮氨酸達到 37 g/L，但繼續增加底物葡萄糖添加量，對谷氨酸棒桿菌菌體生長產生一定的抑制作用，且底物葡萄糖添加量越高抑制作用越強[19]。同時谷氨酸棒桿菌產L-異亮氨酸為生長偶聯型，高生物量有利于產酸速率的提升，菌體生物量與產酸分別比對照組提高了24%和24.8%。

2.1.2 初始葡萄糖添加量對糖酸轉化率及補糖速率的影響

如圖2所示，以30 g/L初始葡萄糖添加量為對照組，考察初始葡萄糖添加量對起始補糖時間、過程補糖速率及糖酸轉化率的影響。

圖2 初始葡萄糖添加量對糖酸轉化率及補糖速率的影響Fig. 2 Effect of initial glucose concentration on glucose-to-acid conversion rate and glucose feeding rate

在發酵初期種子剛接入發酵罐時，菌體處于適應期，以適應新的環境，初始葡萄糖添加量造成的發酵液環境差異會對新生菌體的生長造成影響。一方面提升初始葡萄糖添加量會增加發酵液黏稠度以及胞外滲透壓，造成罐內氧傳遞能力下降及菌體抵抗外界環境刺激難度上升；另一方面提升初始葡萄糖添加量會使菌體長時間處于葡萄糖過量狀態，補糖時間延后，從而推遲菌體進入葡萄糖供需平衡狀態[20]。

由圖2可知，隨著初始葡萄糖添加量的增加，補糖時間逐漸延后，60、90、120 g/L初始葡萄糖發酵補糖時間分別比對照組推遲了2.6、4.5、5.6 h，其中90 g/L的初糖發酵補糖速率最高峰為8.3 g/（L·h），分別比其他底物葡萄糖添加量提前了6、2、8 h，最高峰補糖速率分別提升了13.2%、6.0%和15.7%。菌體耗糖速率與菌體產酸速率共同決定了糖酸轉化率的大小，由圖2可知，90 g/L初始葡萄糖發酵產酸時間最早，糖酸轉化率最高，且最高糖酸轉化率達到了23.2%，平均糖酸轉化率為19.6%。

2.1.3 初始葡萄糖添加量對產酸影響

發酵結束后對主要副產物纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸最終含量進行檢測，結果如圖3顯示，研究表明90 g/L 的初始葡萄糖發酵總產物（L-異亮氨酸+纈氨酸+亮氨酸+丙氨酸）、主產物（L-異亮氨酸）、副產物（纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸）都達到了最高，其L-異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸產量分別為37、6.7、4.3、3.7 g/L，比對照組分別提高了24.6%、34.0%、34.3%、32.1%。谷氨酸棒桿菌發酵產L-異亮氨酸的同時，副產物也會協同增長，且副產物隨著L-異亮氨酸增多而增多，這為后續發酵提取與產品純化帶來困難[21]。

圖3 初始葡萄糖添加量對L-異亮氨酸及副產物的影響Fig. 3 Effect of initial glucose concentration on production of L-isoleucine and by-products

2.2 葡萄糖亞適量流加工藝對L-異亮氨酸的影響

2.2.1 最大補糖速率與葡萄糖亞適量流加工藝對比

當葡萄糖流速率正好與菌體耗糖速率相等時為最大補糖速率，表觀表現形式為發酵罐顯示器中實時溶氧曲線圍繞一個定點波浪前進，微觀表現形式為用SBA生物傳感分析儀檢測發酵上清液顯示葡萄糖質量濃度不大于0.2 g/L（理論發酵上清液葡萄糖含量為0，但流加的葡萄糖不會被瞬時消耗，有一個消耗過程，會顯示0.2 g/L延遲誤差）。其最大補糖速率見圖4，為 0（0～8 h）、6.00～8.30（8～14 h）、8.30～7.78（16～24 h）、7.78～5.58 g/（L·h）（24～40 h）。

圖4 葡萄糖亞適量補糖工藝的補糖速率曲線Fig. 4 Suboptimal glucose feeding rate curves with different peak feeding flow rates

在初始葡萄糖添加量提高到90 g/L的基礎上，以最大補糖速率為對照組，分別依次降低補糖速率為最大補糖速率的90%、80%、70%作為實驗組，探究葡萄糖亞適量補糖工藝對菌體生長及產酸的影響。最大補糖速率的90%葡萄糖亞適量動態補糖速率為 0（0～8 h）、5.40～7.47（8～14 h）、7.47～7.00（16～24 h）、7.00～5.20 g/（L·h）（24～40 h）。

2.2.2 葡萄糖亞適量流加工藝對菌體生物量及產酸的影響

由圖5可知，在以最大補糖速率發酵培養32 h后，菌體死亡率大于存活率，菌體生物量下降，但在3 組葡萄糖亞適量補糖策略下，發酵后期，菌體生物量一直緩慢增長，菌體活力旺盛[22]。由菌體生長曲線可知，0～20 h，飽和葡萄糖消耗有利于菌體生長，以最大補糖速率發酵生物量增長最快，20 h后，最大補糖速率發酵比生長速率負增長，而90%最大補糖速率發酵菌體比生長速率不變，菌體生物量反超，OD600nm達到了146，比最大補糖速率發酵最高菌體生物量高了13.26%，最終菌體量提高了30.32%。由L-異亮氨酸過程增長曲線可知，隨著補糖速率的降低，菌體產酸量逐漸上升，最終在90%最大補糖速率下達到了最高，為43.0 g/L；因此，略低的補糖速率有利于菌體產酸，但過低的補糖速率制約L-異亮氨酸的生成，由產酸曲線可知，亞適量補糖工藝產酸量分別比對照組提升了16.02%、11.12%、0.05%。

圖5 葡萄糖亞適量流加工藝對菌體生物量及產酸的影響Fig. 5 Effects of suboptimal glucose feeding on bacterial biomass and acid production

2.2.3 葡萄糖亞適量流加工藝對副產物生成的影響

谷氨酸棒桿菌發酵產L-異亮氨酸中副產物纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸較多，且隨著發酵時間推移不斷增長，超出菌體耐受水平，對發酵造成不利的影響。纈氨酸、亮氨酸與L-異亮氨酸同為分支鏈氨基酸，共用多種脫水酶、轉氨酶，產酸協同。圖6為最大補糖速率下副產物過程曲線，發酵16 h后，纈氨酸、亮氨酸同時產生，前期增長迅速，后期略微減慢，結束時分別達到了6.72、 4.33 g/L；丙氨酸從發酵開始就不斷增長，且隨著時間推移，產酸速率逐漸上升。分析發現，以最大補糖速率發酵，3 種副產物氨基酸較多，且隨著時間推移都不斷增長，不利于長時間發酵，發酵時間的縮短會導致發酵周期短，L-異亮氨酸產量低，但發酵時間延長，副產物氨基酸增多，轉化率下降，提取困難，不利于產品商業化競爭[23]。

圖6 最大補糖速率下副產物速率曲線Fig. 6 Byproduct production at maximum glucose feeding rate

由圖7可知，最大補糖速率由100%降低至70%，各副產物氨基酸積累都有小幅下降。90%、80%、70%最大補糖速率對比對照組纈氨酸分別下降了40.05%、52.22%、66.46%，亮氨酸分別下降了40.17%、52.35%、66.22%，丙氨酸分別下降了50%、65%、20%。從發酵控制方面使副產物氨基酸的生成減少，能達到代謝流遷移的目的，從而增大合成異亮氨酸的代謝流[24]。

圖7 葡萄糖亞適量工藝產副產物纈氨酸（a）、亮氨酸（b）、 丙氨酸（c）的過程曲線Fig. 7 Time-course curves of production of by-products including Val (a), Leu (b) and Ala (c) with suboptimal glucose feeding at different peak feeding rates

2.3 葡萄糖添加量與葡萄糖亞適量工藝的協調

為協調菌體生物量與開始產酸時間對菌體產酸能力的影響，通過調節初始葡萄糖添加量達到提前進入產酸期的目的，對初始葡萄糖添加量進一步微調。由圖8可知，在一定范圍內，隨著底物葡萄糖添加量的上升，菌體生長速度加快。在發酵40 h后，菌體OD600nm分別達到了130.32、140.25、146.21、153.32，這表示初期高質量濃度初始葡萄糖有利于菌體的生長；由產酸速率可知，在一定范圍內，隨著初始葡萄糖添加量的下降，產酸速率逐漸上升，從100 g/L的底物葡萄糖降到80 g/L發酵，最終產酸達到44.32 g/L，提高了5.53%。

圖8 90%最大補糖速率下不同初始葡萄糖添加量對菌體生物量及 L-異亮氨酸產量的影響Fig. 8 Effects of different initial glucose concentrations on biomass and L-isoleucine yield at glucose feeding rate equal to 90% of maximum feeding rate

谷氨酸棒桿菌發酵產L-異亮氨酸采用高質量濃度初始葡萄糖發酵，能夠提高設備利用率，中后期采用葡萄糖低速流加工藝，可降低滲透壓，使細胞代謝穩定，有利于菌體生長和代謝產物分泌，特別是對高生物量發酵工藝，能提高氧的傳遞速率，提高溶氧水平[25]。

2.4 葡萄糖亞適量工藝對L-異亮氨酸合成及關鍵節點的代謝流的影響

以最大補糖速率發酵為對照組，90%最大補糖速率為優化組，對比理想代謝流，分析胞內各途徑代謝流變化。

2.4.1 6-磷酸-葡萄糖節點代謝流分析

如圖9a所示，葡萄糖進入糖酵解（Embden- Meyerhof-Parnas，EMP）途徑的代謝流為64，比對照組降低了9.28%；進入HMP途徑的代謝流為36，比對照組提高了19.63%，是理論最大值的36%，葡萄糖經HMP和EMP的代謝流之比為0.56。HMP產生的磷酸戊糖全部轉化為EMP途徑中的中間產物，同時為氨基酸的合成提供大量的還原力NADPH，因此提高HMP和EMP的代謝流之比有利于氨基酸的合成[26]。

圖9 L-異亮氨酸代謝流節點分析Fig. 9 Analysis of metabolic flow nodes for biosynthesis of L-isoleucine

2.4.2 丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸節點代謝流分析

磷酸烯醇式丙酮酸通過CO2固定反應生成草酰乙酸，而草酰乙酸是合成其他氨基酸的前體，圖9b中，有34.5的磷酸烯醇式丙酮酸通過CO2固定反應形成草酰乙酸，所以有必要增強TCA循環的回補途徑增強L-異亮氨酸的合成。丙酮酸節點是一關鍵節點，幾種氨基酸的合成以及TCA循環均需丙酮酸的直接或間接參與。因此，改變丙酮酸節點外的代謝流分布，使代謝流向L-異亮氨酸的合成方向遷移對高產L-異亮氨酸具有重要意義[27-29]。從圖9b可以看出，優化組丙酮酸流向主代謝途徑乙酰輔酶A代謝流108.6，比對照組增強了4.1%，流向其他途徑的代謝流，如α-乙酰乳酸、丙氨酸、α-酮異戊酸代謝流分別為38.2、3.0和3.7，比對照組減弱了5.9%、33.3%和69.2%。

2.4.3 蘇氨酸節點代謝流分析

如圖9c所示，蘇氨酸作為L-異亮氨酸的直接前體，優化組天冬氨酸進入蘇氨酸的代謝流比對照組增強了18.92，并全部流向L-異亮氨酸的生成，無蘇氨酸流出。由于TCA循環的回補途徑的增強，直接導致下游途徑生成天冬氨酸增強，有利于L-異亮氨酸的積累。

2.4.4 天冬氨酸節點代謝流分析

由于L-異亮氨酸的6 個碳原子中的4 個碳原子來自于天冬氨酸，同時L-異亮氨酸與蘇氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸一起被稱為天冬氨酸族氨基酸，所以有必要增強天冬氨酸的來源[30]。優化組天冬氨酸進入蘇氨酸的代謝流為34.5，比對照組增強了20.62%，并全部流向蘇氨酸的合成，無缺陷物質賴氨酸積累。

2.4.5α-酮異戊酸節點代謝流分析

由圖9e可知，α-酮異戊酸是主要副產物纈氨酸、亮氨酸的直接前體，削弱合成來源，可減少纈氨酸、亮氨酸的積累。優化組α-乙酰乳酸進入α-酮異戊酸的代謝流為3.7，比對照組減少了69.25%，進入合成Val的代謝流減弱了67.12%，合成亮氨酸的代謝流減弱了72.21%；主要副產物纈氨酸、亮氨酸在理想代謝流分布中為0，說明纈氨酸、亮氨酸在整個代謝過程中可以完全沒有[27,31-32]。在L-異亮氨酸發酵工藝控制中，葡萄糖亞適量是關鍵因素，發酵中后期減少葡萄糖供應有利于L-異亮氨酸的生成，同時可抑制纈氨酸、亮氨酸的產生。

3 結 論

為同時達到菌體生長與產酸能力的最大發酵性能，需要滿足生產潛能所必需的條件。谷氨酸棒桿菌發酵產L-異亮氨酸對環境條件的波動敏感，本實驗所采用的葡萄糖亞適量流加工藝，可以動態調節發酵條件，實現菌體的“發酵轉換”。在發酵初始葡萄糖為80 g/L，90%最大補糖速率的亞適量補糖工藝下，得到動態補糖速率為0（0～8 h）、5.40～7.47（8～14 h）、7.47～7.00（16～24 h）、7.00～5.20 g/（L·h）（24～40 h），OD600nm達到146，比最大補糖速率發酵提高了13.22%。該工藝優化了代謝流通量，從發酵控制方面使副產物氨基酸的生成減少，達到代謝流遷移的目的，從而增大合成L-異亮氨酸的代謝流，使得L-異亮氨酸產量達到了44.32 g/L，糖酸轉化率提升到19.63%，同時副產物纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸分別降低到4.02、2.58、1.85 g/L 。