香菇真空冷凍干燥過程中滋味物質動態 變化及鮮味評價

盧曉爍，張毅航，方東路，范 霞，胡秋輝，陳計巒，趙立艷,

（1.南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095；2.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003）

香菇（Lentinula edodes）是常見的食用菌之一，長期以來，其因營養價值高而成為備受消費者喜愛的食物[1]。與此同時，香菇還具有獨特的鮮香風味，所以其常被選作食品調味原料[2]。但由于香菇產量大且含水率高，多數采收后的香菇被制成干品以延長其保質期[3]。真空冷凍干燥（vacuum freeze-drying，VFD）是當前常用的一種脫水干燥技術，它雖然在我國食品工業中起步較晚，但近年來發展迅速，其突出優勢在于能有效保留食品原有的色香味和營養成分等[4]，故適用于食用菌及其產品的加工[5]。

隨著食用菌產業的發展壯大，檢測及分析食用菌的風味對評價其品質愈發重要。食品的風味特征涵蓋2 個方面，即氣味與滋味，前者主要源自揮發性化合物，而后者主要由非揮發性化合物貢獻。以往國內外學者對香菇風味物質的研究多聚焦在揮發性成分上，尤以鮮菇及其干品中揮發性化合物的定性和定量分析[6-7]、不同方式干制的香菇中揮發性組分的差異比較[8-10]為主。近年來，不同品種的香菇子實體和市售干香菇中的非揮發性風味物質也被廣泛關注[11-13]。據研究，香菇的鮮美口味主要來源于幾種水溶性小分子物質，包括可溶性糖（醇）、5’-核苷酸、游離氨基酸和有機酸[14]，它們能有效提高食品的適口性[15]。現如今在滋味屬性的評價方面，電子舌越來越受科研人員青睞，因其能模仿人類的味覺感受機制，并高效、準確地評估滋味物質對主要味覺特征的影響[16]。 香菇的非揮發性化合物是其滋味屬性的重要組分，然而，關于香菇干制過程中滋味組分的動態變化鮮有研究。因此，為了探究香菇VFD過程中滋味物質的變化規律，本實驗對該過程進行跟蹤取樣，通過電子舌技術確定不同VFD階段香菇的滋味特征，利用高效液相色譜儀和氨基酸分析儀測定可溶性糖（醇）、呈味核苷酸、有機酸和游離氨基酸，此外，借助等鮮濃度（equivalent umami concentration，EUC）的變化反映鮮味強度的改變。本研究旨在為深入了解VFD過程中香菇滋味物質的變化機制提供理論依據，并指導以香菇為基料的低鈉調味品開發。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇（品種：808）購于南京市衛崗蘇果超市。

可溶性糖（醇）、核苷酸、有機酸標準品 上海源葉生物科技有限公司；氨基酸混合標準溶液 日本Wako公司；所有分離用有機溶劑均為國產色譜純。

1.2 儀器與設備

70-2臺式切片機 鎮江金匯緣食品機械有限公司； LyoBeta 15真空冷凍干燥機 西班牙Telstar公司； SA-402B電子舌 北京盈勝恒泰科技有限責任公司；1200液相色譜儀 美國Agilent公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日立高新技術公司；TDZ5-WS型臺式離心機 湖南湘儀儀器開發有限公司；KQ-250DB數控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；N-1001旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 VFD工藝流程及操作要點

工藝流程[17]：鮮香菇→預凍→升華干燥（I階段干燥）→解析干燥（II階段干燥）→干制品。

操作要點：挑選肉質飽滿、大小均勻（菌蓋直徑約為5.0～5.5 cm）的新鮮且未開傘的香菇，去除部分菌柄（修剪至長度約為1.0 cm），然后清洗、瀝水、切片（厚度約5 mm），接著在－30 ℃下預冷凍12 h后，立即將其置于儀器干燥室內進行VFD[18]。設置真空壓力為40 Pa；升華干燥溫度為10 ℃，解析干燥溫度分別為20、30、40 ℃和50 ℃。當水分質量分數降至13%以下[19]時停止干燥。在VFD的每個關鍵步驟結束時取樣，其中新鮮樣品、預凍后的樣品（SM0）和升華干燥后的樣品（SM1）在收集后立即用液氮冷凍并貯存在－80 ℃的超低溫冰箱中待用；解析干燥后的樣品（4 個溫度下分別記為SM2、SM3、SM4和SM5）研磨成粉并過60 目篩，置于干燥器中避光保存待用。

1.3.2 電子舌檢測

稱取各香菇樣品1.000 0 g（以干質量計）于燒杯中，加入40 mL蒸餾水攪拌，然后將其轉入離心管中4 000 r/min離心20 min，離心后取上清液定容至100 mL用于電子舌測量[20]。

1.3.3 可溶性糖（醇）的測定

參考Pei Fei等[21]的方法并略微調整，稱取各香菇樣品0.500 0 g（以干質量計），加入30 mL體積分數為80%乙醇溶液，于60 ℃水浴提取30 min，然后4 000 r/min離心20 min。取出上清液，將殘渣用相同的方法反復2 次進行提取。最后合并上清液于旋轉蒸發儀中濃縮至干，并隨即用75%乙腈溶解定容至10 mL。取溶解液經0.45 μm濾膜過濾后待測。

色譜條件：采用Sugar-D色譜柱（4.6 mm× 250 mm），柱溫30 ℃；流動相為超純水-乙腈（25∶75，V/V），等度洗脫，流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；采用蒸發光散射檢測器；N2流速2.1 L/min；漂移管溫度81 ℃。根據標準品的出峰時間及峰面積，繪制標準曲線計算樣品中相應物質的含量。結果以干基計。

1.3.4 呈味核苷酸的測定

參照Li Biao等[22]的方法稍作修改，稱取各香菇樣品0.500 0 g（以干質量計），加入30 mL超純水，煮沸1 min后冷卻，然后4 000 r/min離心20 min。取出上清液，將殘渣用相同的方法反復2 次進行提取。最后合并上清液于旋轉蒸發儀中濃縮至干，并隨即定容至10 mL。取溶解液經0.45 μm濾膜過濾后待測。

色譜條件：Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃；流動相為超純水-甲醇-冰乙酸-四丁基氫氧化銨（894.5∶100∶5∶0.5，V/V）， 等度洗脫，流速0.6 mL/min；進樣量20 μL；采用紫外檢測器，檢測波長為254 nm。根據標準品的出峰時間及峰面積，繪制標準曲線計算樣品中相應物質的含量。結果以干基計。

1.3.5 游離氨基酸的測定

稱取各香菇樣品0.500 0 g（以干質量計），加入質量濃度為10 g/L的磺基水楊酸2 mL和10 g/L的 EDTA-2Na 1 mL，混合均勻后超聲處理1 h，靜置過夜。用0.02 mol/L鹽酸復溶并定容至25 mL，取溶解液經0.45 μm濾膜過濾后待測。采用氨基酸自動分析儀對游離氨基酸進行測定，根據標準品的出峰時間及峰面積計算樣品中各游離氨基酸含量[23]。結果以干基計。

1.3.6 有機酸的測定

參考余科林[24]的方法并略微改動，稱取各香菇樣品0.500 0 g（以干質量計），加入0.01 mol/L的KH2PO4溶液（pH 2.80）10 mL，于45 ℃超聲提取30 min。然后4 000 r/min離心20 min，最后取上清液定容至10 mL。取溶解液經0.45 μm濾膜過濾后待測。

色譜條件：采用Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃；流動相為KH2PO4（0.01 mol/L，pH 2.80）-甲醇（95∶5，V/V），等度洗脫，流速0.6 mL/min；進樣量20 μL；采用紫外檢測器，檢測波長210 nm。根據標準品的出峰時間及峰面積，繪制標準曲線計算樣品中相應物質的含量。結果以干基計。

1.3.7 EUC的計算

EUC常用于表征食品的鮮味強度[25]。它是根據鮮味氨基酸和呈鮮核苷酸計算得到，按下式計算[26]：

式中：EUC按每100 g干樣品含谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）質量計/（g/100 g）；ai為天冬氨酸或谷氨酸含量/（g/100 g）；aj為5’-鳥苷酸或5’-腺苷酸含量/（g/100 g）；bi為每種鮮味氨基酸相對于Glu的值（Glu=1，Asp=0.077）；bj為每種呈鮮核苷酸相對于5’-肌苷酸的值（5’-鳥苷酸=2.3，5’-腺苷 酸=0.18）；1 218為基于單位g/100 g的協同常數。

1.4 統計分析

采用Excel、Origin 95和IBM SPSS Statistics 22軟件對數據進行處理和統計分析。其中方差分析采用ANOVA程序，多重比較分析采用LSD法，顯著性水平為0.05。每組實驗平行測定3 次，結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 電子舌評價

電子舌是根據傳感器表面的人工雙層脂質膜與呈味物質之間發生的靜電作用或疏水作用選擇滋味成分，并通過隨之發生改變的電勢將味道轉化為數值形式，從而使傳感器的響應量化[27]。電子舌系統由5 個味覺傳感器組成，能夠檢測酸味、苦味、澀味、鮮味和咸味物質。利用電子舌系統評價不同VFD階段的香菇樣品之間的滋味特征差異，結果如圖1a所示。與鮮香菇相比，預凍后香菇（SM0）的滋味輪廓變化幅度小，升華干燥后香菇（SM1）的滋味輪廓明顯改變，而20、30、40 ℃和50 ℃解析干燥后香菇（SM2～SM5）的滋味輪廓變化程度不同，表明在解析干燥過程中香菇滋味物質的變化受溫度影響。此外，在香菇VFD過程中每種滋味特征的變化情況不同，其中最明顯的變化是在不同溫度的解析干燥后，香菇的酸味、苦味及苦味回味強度增加，這可能與有機酸和苦味氨基酸的含量增加有關。

圖1 香菇VFD過程中滋味物質的電子舌分析Fig. 1 E-tongue data of taste compounds in L. edodesduring vacuum freeze-drying

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種多元統計分析方法，其作用是通過變換和降維，最終以簡化的信息反映原始數據[28]。為進一步分析不同VFD階段香菇間的差異，基于電子舌雷達圖反映的評價結果，選擇樣品中鮮味、咸味、酸味、苦味和苦味回味的電子舌響應值進行PCA，得到PC1和PC2的貢獻率分別為71.1%和23.4%，其累計貢獻率達94.5%，因超過90%，故這2 個PC能較好地反映原始信息。如圖1b所示，對PC1影響最大的是咸味，其次為鮮味，而苦味和酸味對PC2的影響較大。在圖1b中，香菇鮮樣與預凍后的香菇樣品（SM0）分布最集中，更加說明預凍前后香菇的整體滋味特征變化不大。升華干燥后的樣品（SM1）與解析干燥后的樣品（SM2～SM5）主要沿PC1分離，其中鮮味、咸味、苦味及苦味回味對樣品間區分貢獻較大。而解析干燥后的樣品除SM2外聚集分布，PC2更多地體現出它們之間的差別，尤其是在酸味特征上。

2.2 可溶性糖（醇）變化與分析

香菇含有的可溶性糖（醇）是其甜味的主要貢獻者。如表1所示，本實驗在不同VFD階段的香菇樣品中共檢測到1 種單糖（果糖）和3 種可溶性的糖醇（阿拉伯糖、甘露醇、海藻糖）。在本研究的香菇樣品中，阿拉伯糖和海藻糖的含量均比其在陳萬超等[13]測定的市售干香菇中低，可能是因為香菇的品種和干燥方式的差異。由表1可知，在香菇的可溶性糖（醇）中，甘露醇含量最高，這一結果同Yang等[29]研究。香菇經預凍后，其果糖、甘露醇和海藻糖的含量顯著高于鮮樣（P＜0.05），可能是應激反應所致。香菇經升華干燥后，其阿拉伯糖、果糖、甘露醇和海藻糖的含量繼續增加，表明該過程有利于香菇內源的可溶性糖（醇）大量釋放。隨著解析干燥溫度的升高，香菇中可溶性糖（醇）的含量逐漸降低，可能是因為在30、40 ℃和50 ℃解析干燥階段，這3 種樣品（SM3～SM5）中阿拉伯糖、果糖和甘露醇與游離氨基酸發生美拉德反應。而受解析干燥溫度的影響，香菇中的海藻糖與另外3 種可溶性糖（醇）相比，其含量的波動變化更加明顯，這可能與其是一種典型的細胞應激代謝物密不可分[30]。

表1 香菇VFD過程中可溶性糖（醇）含量變化Table 1 Changes in contents of soluble sugars/mannitols in L. edodes during vacuum freeze-drying

2.3 呈味核苷酸變化與分析

5’-核苷酸是香菇中典型的鮮味成分。本實驗中共檢測到4 種單核苷酸，分別為5’-胞苷酸、5’-腺苷酸、5’-鳥苷酸和5’-尿苷酸，這與于海龍等[11]的研究結果相似。由表2可知，香菇經預凍后，每種核苷酸的含量均顯著升高（P＜0.05），這可能是因為樣品受細胞破裂的影響，其細胞中的核糖核酸酶可以更加充分地作用于核糖核酸[31]。 樣品經升華干燥后，只有5’-胞苷酸含量顯著下降 （P＜0.05）且其低于鮮香菇中的含量，而5’-腺苷酸含量顯著升高（P＜0.05），由此表明，伴隨著水分流失，香菇中各種核苷酸的含量及其比例也在發生變化。香菇經不同溫度的解析干燥后，5’-胞苷酸的含量表現出不同程度的上升趨勢，并且在20、40 ℃和50 ℃解析干燥后的干香菇（SM2、SM4和SM5）中其含量均顯著高于鮮樣中的含量（P＜0.05），該結果與于海龍等[11]發現的市售干香菇制作過程中5′-胞苷酸含量上升一致。 5’-鳥苷酸是香菇鮮味的突出貢獻者[16]，在30、40 ℃和50 ℃解析干燥后的樣品（SM3～SM5）中其含量均多于鮮香菇中的含量，尤其是30 ℃和40 ℃解析干燥后的樣品中其含量顯著高于鮮樣中的含量（P＜0.05）。本實驗中所得干制香菇的5’-核苷酸總量增加，該結果與Dermiki等[31]的研究結果相似，表明VFD有利于香菇生成與保留其中大部分呈味核苷酸，特別是當解析干燥溫度為40 ℃時效果更佳。

表2 香菇VFD過程中呈味核苷酸含量變化Table 2 Changes in contents of 5’-nucleotides in L. edodes during vacuum freeze-drying

2.4 游離氨基酸變化與分析

如表3所示，香菇鮮樣的游離氨基酸總量為33.49 mg/g， 與Xu Lei等[32]報道的新鮮香菇中游離氨基酸總量（31.70 mg/g）相似。不同VFD階段的香菇中游離氨基酸總量為24.48～44.76 mg/g，其中Thr占比最大（18%～34%），這與于海龍等[11]報道大體一致（Thr占香菇游離氨基酸總量的13%～42%）。由表3可知，香菇預凍前后，各游離氨基酸的含量變化不顯著（除Asp、Ala、Cys和Lys）。而經過升華干燥后，樣品中大部分游離氨基酸的含量增加，其中甜味氨基酸（Thr+ Ser+Gly+Ala+Pro）、苦味氨基酸（Val+Met+ Ile+Leu+Phe+His+Arg）和無味氨基酸（Cys+Tyr+Lys）含量顯著高于鮮樣中的含量（P＜0.05）；此時游離氨基酸的總量較高，可能是由于升華干燥階段蛋白質發生水解。Tian Yuting等[33]在研究干燥方法對香菇質量的影響時發現高溫可以促進蛋白質的水解，干燥后香菇的游離氨基酸總量顯著增加（P＜0.05）。由于本實驗中的干燥方法更加溫和，在不同溫度的解析干燥階段，樣品中游離氨基酸總量均呈現下降趨勢，但它們之間（SM2～SM5）有所差別，其中20 ℃解析干燥后的香菇中游離氨基酸總量顯著下降（P＜0.05）并為最小值，而30 ℃和50 ℃解析干燥后的樣品中游離氨基酸總量仍高于鮮樣。結合上述可溶性糖（醇）的含量變化推測，在解析干燥過程，Ser、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Phe、His、Arg、Cys、Lys可能與糖發生美拉德反應，致使游離氨基酸總量有降低的趨勢，并且降低程度受解析干燥溫度的影響。

表3 香菇VFD過程中游離氨基酸含量變化Table 3 Changes in contents of free amino acids in L. edodes during vacuum freeze-drying

2.5 有機酸變化與分析

香菇中有機酸的種類和含量與其滋味形成緊密相關[34]。 而由于香菇的品種和生長環境不同以及有機酸提取方法各異，市售香菇中的有機酸組成及其含量差異較大[35]。本實驗選取食用菌滋味評價中6 種常用的有機酸進行測定，結果見表4。在香菇VFD過程中，酒石酸含量呈現出先降低后升高的趨勢，蘋果酸則相反，而冰乙酸含量持續上升，琥珀酸僅在30、40 ℃和50 ℃解析干燥后含量顯著升高（P＜0.05）。檸檬酸的含量變化幅度不大，是因為與其他有機酸相比，其具有良好的熱穩定性[36]。Li Xiaobei等[37]研究表明，干燥有利于釋放更多的酒石酸和冰乙酸，本研究獲得了類似結果。可能是因為隨著樣品溫度的升高，香菇中相關酶被激活，從而極大地促進了有機酸的形成[21]。從有機酸總量看，香菇VFD后其顯著增加（P＜0.05）且不受解析干燥溫度的影響，這也證明了在電子舌檢測時可以利用酸味將解析干燥后的香菇樣品與其他樣品區分開。

表4 香菇VFD過程中有機酸含量變化Table 4 Changes in contents of organic acids in L. edodes during vacuum freeze-drying

2.6 EUC比較

由于鮮味是食用菌最突出的滋味特征，并且當鮮味氨基酸與呈味核苷酸同時存在時，二者產生的協同效應能顯著提高鮮味強度[38]，因此為了進一步全面分析香菇VFD過程中鮮味的變化情況，本研究利用EUC值的變化反映鮮味強度的改變，結果如圖2所示。預凍后香菇的EUC值（92.00 g/100 g）有升高的趨勢，但與鮮香菇的EUC值（78.96 g/100 g）無顯著性差異，表明預凍后香菇的鮮味強度并未顯著提高。升華干燥后香菇的EUC值（100.19 g/100 g）進一步增加，并且顯著高于鮮樣的EUC值（P＜0.05），表明升華干燥階段有效提高了香菇的鮮味強度。20 ℃解析干燥后香菇的EUC值降至整個VFD過程的最低點，為58.35 g/100 g，并且顯著低于鮮樣的EUC值（P＜0.05），這是由該階段香菇中鮮味氨基酸的含量降低導致。而與鮮香菇相比，30、40 ℃和50 ℃解析干燥后香菇的鮮味強度增加了約1 倍，EUC值在149.91～188.66 g/100 g之間，表明適當升高解析干燥溫度有利于提高香菇干制品的鮮味強度。

圖2 香菇VFD過程中EUC值變化Fig. 2 Changes of EUC values in L. edodes during vacuum freeze-drying

3 結 論

電子舌能有效評價不同VFD階段香菇間的滋味差異。經高效液相色譜儀和氨基酸分析儀檢測發現，香菇的滋味物質在VFD的預凍、升華干燥和解析干燥階段存在如下的變化規律：鮮香菇經預凍后其可溶性糖（醇）和5′-核苷酸含量均顯著增加（P＜0.05）。在升華干燥后，香菇的可溶性糖（醇）和游離氨基酸含量均增加為整個VFD過程的峰值。在解析干燥階段，香菇的有機酸含量增加且不受解析干燥溫度的影響；然而，可溶性糖（醇）和游離氨基酸含量均隨溫度變化呈現不同的下降趨勢，這有待進一步研究是否與美拉德反應有關。

總之，VFD過程能很好地保留香菇中大多數滋味成分，這有利于增強呈味物質之間的協同效應從而豐富香菇的滋味特征。特別是在溫度高于20 ℃的解析干燥后，香菇的鮮味強度得到了有效提高。鑒于滋味是評價食品品質的一個重要指標，本研究為深入了解香菇在VFD過程中其滋味物質變化機制提供基礎理論，并且可指導以香菇為基料的滋味物質開發提供參考。