低劑量暴露下呋喃唑酮在大菱鲆體內的 遷移規律及預測

邢麗紅，孫偉紅，*，李沂光，彭吉星，李兆新，翟毓秀，*

（1.農業農村部水產品質量安全檢測與評價重點實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室，山東 青島 266237；3.大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034）

食品安全問題目前已成為人們關注的一個重要主題。由于抗生素在畜牧業和水產養殖中廣泛使用，相當一部分抗生素進入環境中，造成環境抗生素殘留以及耐藥細菌的傳播，最終危害人體健康[1-3]。越來越多的學者開始關注抗生素的環境污染、環境生態毒性及其耐藥性[4-6]， 并建立了一系列用于監測水體[7-9]、飼料[10-17]和沉積物[18-20]等復雜基質中抗生素殘留的高靈敏度檢測方法。歐盟為收集和快速發布監測數據，建立了食品和飼料快速預警系統以保障消費者食用安全[21-22]。

呋喃唑酮是人工合成的具有5-硝基結構的廣譜抗菌藥物，在水產養殖中曾用來預防和治療革蘭氏細菌引起的腸胃道疾病[23]，是最常見的一種硝基呋喃類藥物。該類藥物還具有促生長作用[24]，因此曾作為飼料添加劑在畜牧業和水產養殖中廣泛使用[1,8,13,24]。硝基呋喃類藥物半衰期很短，在動物體內代謝迅速，而與蛋白結合的代謝產物在生物體內則能長期穩定殘留[22]，并具有顯著的致畸、致癌和誘導機體產生突變的作用[17,23]。 出于安全性考慮，歐盟、美國和日韓等發達國家先后頒布了禁止使用該類獸藥的規定[1]。我國于2002年明令禁止在食用動物上使用硝基呋喃類藥物，并規定在動物源性食品中不得檢出。近年來我國加大了食品安全的監控和執法力度，特別是對漁用投入品的生產、銷售和使用進行了有效監督和管理，但仍在少量水產品中發現了痕量硝基呋喃類代謝物殘留。開展水產品中痕量藥物殘留的來源、遷移規律和風險預測等方面的研究，可以減少養殖過程的風險隱患，為保障水產品的食用安全提供參考。

動物體內殘留的痕量硝基呋喃代謝物，可能源于養殖環境中被污染的飼料或水體。Mccracken等[25]研究發現，在雞飼料中當呋喃唑酮以30 μg/kg劑量（0.01%治療劑量）連續投喂12 d時，肝臟和肌肉中的呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）殘留量分別為（1.1±0.2）μg/kg和（0.33±0.03）μg/kg，說明雞肉中殘留的硝基呋喃類代謝物可能來源于日常飲食或環境污染。Jakiul等[26]為了確定凍蝦生產過程中禁用藥物硝基呋喃和氯霉素的來源途徑，對投入品包括飼料、飼料添加劑、飼料成分、沉積物和水樣等進行檢測，結果表明使用受到抗生素污染的飼料或飼料原料及養殖水體，會導致抗生素在蝦體內殘留。同樣，Conti等[27]也在飼料和食用該飼料的魚體內檢測到呋喃唑酮和呋喃它酮代謝物殘留。Rizala等[28]開展動物飼料中硝基呋喃類、硝基咪唑類和四環素類3 類抗生素殘留評估，發現飼料中存在一定程度的抗生素污染。上述研究證明養殖環境中存在硝基呋喃等抗生素的污染來源，并導致雞、蝦、魚等體內的藥物殘留，但是還不清楚生物體內抗生素殘留量與環境受污染程度的相關關系及可能帶來的風險。

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是我國北方重要的海水魚養殖品種，硝基呋喃藥殘事件曾經對大菱鲆產業造成毀滅性打擊。本實驗選取大菱鲆作為研究對象，開展飼料中低劑量呋喃唑酮藥物在其體內的富集傳遞規律研究，確定生物富集系數（bioaccumulation factor，BCF）、預測呋喃唑酮污染水平對大菱鲆體內AOZ殘留量的影響，研究結果將有助于評價養殖環節中呋喃唑酮的帶入風險，同時也為大菱鲆的食用安全和合理執法提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大菱鲆、制作飼料用魚粉等原料購自海陽市黃海水產有限公司。

呋喃唑酮（純度＞98%） 上海阿達瑪斯試劑有限公司；AOZ、AOZ-D4標準品 德國Witega公司； 甲醇、乙酸乙酯、二甲亞砜、乙酸銨、2-硝基苯甲醛（均為色譜純） 德國Merck公司；鹽酸、磷酸氫二鉀（均為優級純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LC20液相色譜儀 日本島津公司；5500液相色譜-質譜聯用儀（配有電噴霧離子源） 美國AB SCIEX 公司；分析天平（感量0.01 g） 德國賽多利斯集團；高速離心機（6 000 r/min） 美國Thermo Fisher公司；微量高速離心機（14 000 r/min） 德國Sigma公司；渦旋混合器 美國Talboys公司；Gradient A10 Mill-Q超純水儀 美國Millipore公司；N-EVAP 112氮氣吹干儀 美國Organomation公司；IS-RDS3恒溫振蕩器 美國精騏有限公司。

1.3 方法

1.3.1 呋喃唑酮飼料制作

將飼料按照大菱鲆配料比例充分混合均勻，在飼料中分別以添加量0.5、1.5 mg/kg和5.0 mg/kg添加呋喃唑酮，充分攪拌混合均勻后，用制料機制成顆粒飼料，－20 ℃冷凍保存。

1.3.2 養殖實驗

1.3.2.1 實驗動物

實驗前隨機挑選健康、活潑、平均體質量為（500±50）g的大菱鲆，在2.5 t圓形養殖缸中暫養2 周后用于實驗。實驗前檢測表明，大菱鲆各組織和養殖實驗海水及飼料中均無呋喃唑酮及其代謝物殘留。馴養期間飼喂不含呋喃唑酮的飼料。海水經砂濾，無污染，實驗過程中24 h不間斷充氣，水溫（16±2）℃，pH 8，溶解氧7.5 mg/L，總硬度8 DH。

1.3.2.2 實驗給藥及采樣

實驗前將大菱鲆隨機分為對照組和實驗組，分別編號，稱量，記錄。對照組投喂不添加呋喃唑酮的飼料。實驗組設低、中、高3 個添加水平，呋喃唑酮添加量分別為0.5、1.5 mg/kg和5.0 mg/kg。實驗組每日投喂含有呋喃唑酮的飼料，日投喂量為體質量的1%，每日投喂2 次，上午和下午各一次。整個實驗過程采用循環海水養殖。分別于投喂飼料后的0、5、10、15、20、25 d和30 d采集大菱鲆樣品。每次采樣時，隨機采集6 尾魚，用空白海水沖洗干凈體表，分別取肌肉、皮、鰓、肝臟、腎臟、脾臟組織，于－20 ℃冷凍保存。

1.3.3 樣品處理

按照農業部783號公告-1-2006進行樣品前處理并作適當改進。

稱取2 g樣品于50 mL聚丙烯離心管中，準確加入50 μL內標溶液，渦旋混合50 s，再加入5 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液和0.15 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋混合50 s后，置于恒溫振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。取出離心管冷卻至室溫，加入1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液，調節pH 7.0～7.5，加入乙酸乙酯8 mL，渦旋振蕩1 min，8 000 r/min離心5 min，取上層清液轉移至10 mL離心管中，于40 ℃氮氣吹干。準確加入5%甲醇溶液1.0 mL，充分渦旋振蕩溶解殘留物，再將溶液轉移至1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心10 min，取下層清液過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜分析。

1.3.4 樣品測定

液相色譜條件：色譜柱：Waters XBridge C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流速：0.35 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A為0.002 mol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

質譜條件：離子化模式：電噴霧離子源，正離子模式；噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；碰撞氣Medium；氣簾氣壓力30 psi；霧化器壓力35 psi；輔助加熱氣壓力35 psi；去簇電壓80 V；射入電壓10 V；碰撞室射出電壓10 V；掃描模式：多反應選擇監測，選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量見表2。

表2 選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量Table 2 Mother ion, daughter ion and collision energy in selective reaction monitoring mode

1.4 數據處理

若實驗結束時魚體中藥物含量變化已基本達到平衡，此時魚體對藥物的BCF按式（1）計算：

式中：Cfs為平衡時魚體藥物含量/（μg/kg）；Cws為平衡時飼料中藥物含量/（mg/kg）。

若實驗結束時，魚體中藥物含量未達到平衡，用BCF30d表示。

采用MetaLab軟件進行數據擬合并建模，BCF的計算每個時間點6 個平行樣品，以±s表示，相關系數R的顯著性差異通過查閱相關系數顯著性檢驗表進行分析。

2 結果與分析

2.1 大菱鲆組織中AOZ殘留量與飼料添加量關系

在低劑量暴露條件下（0.05%～0.5%治療劑量），連續投喂含呋喃唑酮的飼料30 d，在大菱鲆肌肉、皮、肝臟、腎臟、鰓和脾各組織中均能檢測到呋喃唑酮代謝物AOZ殘留。以呋喃唑酮添加量為自變量x，以AOZ殘留量為因變量y進行線性回歸分析，結果表明，大菱鲆各組織中AOZ的殘留量與呋喃唑酮添加量具有良好的線性關系。查閱相關系數顯著性檢驗表[29]可知，當n=6時，0.811≤R＜0.917表示 0.01＜P≤0.05，顯著相關，R≥0.917時表示P≤0.01，極顯著相關。由表3可知，各組織中線性方程相關系數均大于0.917，達到極顯著水平，即隨著飼料中呋喃唑酮添加量的增大，大菱鲆各組織中AOZ殘留量隨之增大，呈顯著正相關。線性方程斜率越大，表明相應組織中AOZ的殘留量越高。我國農業部783號公告-1-2006規定了硝基呋喃類代謝物檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。當呋喃唑酮添加量為0.5 mg/kg時，連續暴露5 d，可食組織肌肉中AOZ即可檢出（0.44 μg/kg）， 連續暴露30 d時，肌肉組織中AOZ殘留量即達到 0.68 μg/kg，飼料在受到低劑量呋喃唑酮污染或低劑量違禁添加的情況下，呋喃唑酮代謝物AOZ在大菱鲆體內存在蓄積的風險。

表3 大菱鲆各組織中AOZ殘留量與飼料中呋喃唑酮添加量線性方程Table 3 Linear equations between AOZ residue in various tissues of turbot and dose of furazolidone added to feed

Mccracken等[25]為了證明雞肉中殘留的硝基呋喃類代謝物可能來源于日常飲食或環境污染，按照3 000 μg/kg劑量飼喂雞12 d后，將這些雞轉移，在雞舍不做清潔的情況下，重新放入體內不含硝基呋喃類代謝物的雞，并攝食不含硝基呋喃的飼料和水，24 h后在其肌肉和肝臟中分別檢測到AOZ殘留，殘留量分別為（0.13±0.04）μg/kg 和（0.01±0.03）μg/kg。Mccracken等[25]此前研究還發現，將豬置于曾受過藥物治療但未清潔徹底的豬圈中暴露2 h，可明顯檢測到AOZ殘留。Jakiul等[26]對160 份飼料和飼料成分中的硝基呋喃類代謝物進行檢測發現，11 份蝦飼料和10 份魚飼料中檢出了硝基呋喃類代謝物，蝦制品中硝基呋喃類抗生素污染來源于兩方面：1）受污染的飼料和飼料成分；2）在混養過程中使用禽類糞便肥水，而這些禽類從開始養殖時便濫用抗生素。Conti等[27]對同一個養殖場的30 份飼料和食用該飼料的魚體采用酶聯免疫吸附劑測定試劑盒對其抗生素含量進行測定，結果在飼料中檢出包含硝基呋喃類代謝物AOZ和AMOZ在內的7 類抗生素殘留，肌肉中AOZ和AMOZ的平均含量分別為0.09 μg/kg和0.29 μg/kg。在水源和飼料等受低劑量抗生素污染的條件下，硝基呋喃類藥物在動物體內存在蓄積的風險。

2.2 AOZ殘留量-時間曲線圖（Ci-Ti）

在飼料中分別添加0.5、1.5 mg/kg和5.0 mg/kg呋喃唑酮藥物，其標示性代謝物AOZ在大菱鲆肌肉、皮、肝臟、脾、腎臟和鰓中的殘留量隨時間變化的Ci-Ti見圖1。

圖1 大菱鲆各組織中AOZ殘留量隨時間變化曲線Fig. 1 Changes in AOZ residue in tissues with feeding time

由圖1可以看出，隨著呋喃唑酮添加量的升高和暴露時間的延長，AOZ在大菱鲆各組織中的殘留量逐漸增加并趨于穩定。當飼料中呋喃唑酮添加量為0.5 mg/kg時，AOZ在肌肉、皮和肝臟中達到穩態富集的時間均為15 d，在脾中5 d達到穩態富集，在腎臟和鰓中10 d達到穩態富集。添加量為1.5 mg/kg時，AOZ在肌肉、皮、肝臟、脾、腎臟和鰓中均15 d達到穩態富集，但在脾中出現一定程度波動變化。添加量為5.0 mg/kg時，AOZ在肌肉、皮、肝臟、腎中25 d達到富集平衡，脾和鰓中15 d達到富集平衡，并在之后出現一定程度的波動上升和下降，30 d時AOZ殘留量在各組織中略有下降，可能是由于AOZ在體內達到富集平衡后，消除速率大于代謝速率，因而AOZ殘留量出現一定程度下降。

在飼料中添加不同水平的呋喃唑酮藥物，AOZ在大菱鲆不同組織中達到穩態富集的時間各不相同，且AOZ在同一組織中的殘留量也有差異。對于同一組織而言，在飼料中隨著呋喃唑酮添加量的增大，AOZ在各組織中的殘留量相應增大，在飼料中達到穩態富集的時間也越長。

2.3 AOZ在大菱鲆各組織中的分布特征

大菱鲆食用含有呋喃唑酮的飼料后，在體內快速代謝，在很短時間內即可轉化成代謝產物AOZ，并以蛋白結合態形式穩定存在。AOZ在大菱鲆各組織中的殘留量見圖2。

圖2 不同富集時間下AOZ在大菱鲆各組織中的分布Fig. 2 Distribution of AOZ in various tissues of turbot at different enrichement times

隨著飼料中呋喃唑酮添加量的增加，其代謝物AOZ在大菱鲆各組織中的殘留量也相應增加，其分布呈相似的規律，AOZ殘留量由大到小依次為肝臟＞腎臟＞脾＞ 鰓＞皮＞肌肉，AOZ在肝臟組織中的殘留量最高，在肌肉中最低。魚皮中AOZ的殘留量略高于肌肉組織，鰓絲中AOZ殘留量約是肌肉的2～3 倍，而肝臟中AOZ殘留量是肌肉的4～6 倍，腎臟中AOZ殘留量略低于肝臟，脾臟和鰓中AOZ殘留量較為接近。肝臟、脾、腎臟和鰓是參與代謝的重要組織器官，因此也是AOZ殘留量較高的組織。進入體內的呋喃唑酮藥物在生物體內各種酶的作用下，轉化為代謝產物，并蓄積在肝臟、腎臟等組織器官中，而后分布到肌肉和皮可食組織中。

2.4 呋喃唑酮在大菱鲆體內生物富集能力

生物富集作用是指污染物從環境中進入生物體內蓄積，進而在食物鏈中傳遞與富集的能力。污染物的生物富集作用越強，對生物的污染程度與慢性危害作用越大。通常以BCF度量污染物在生物體內累積的趨勢，并作為描述生物對污染物質富集效應的指標。

同一添加水平下，隨著富集時間的延長，AOZ在同一組織中的BCF逐漸升高并趨于穩定，藥物進入魚體后，富集過程與代謝過程是并存的，初期富集過程大于代謝過程，在后期富集和代謝過程逐漸達到平衡。但不同組織對AOZ的生物富集能力不同，AOZ在皮組織中的BCF大于在肌肉組織中的BCF，表明AOZ在魚皮中更容易蓄積，推測可能是魚皮中蛋白含量高于肌肉組織，而AOZ在體內主要以蛋白結合態形式存在，因而AOZ更容易蓄積在蛋白含量更高的魚皮組織中。不同添加量下，AOZ在同一組織中的BCF存在差異，大菱鲆體內AOZ的蓄積量隨添加量增大而增大，但與飼料中的添加量并不呈等比關系，在低添加水平條件下呋喃唑酮藥物在大菱鲆體內的BCF比高添加水平高。AOZ在肌肉和皮中的BCF見圖3。

圖3 AOZ在大菱鲆肌肉（A）和皮（B）中的BCFFig. 3 Bioconcentration factors of AOZ in the muscle (A) and skin (B) of turbot

李永仁等[30]在研究毛蚶對石油烴的BCF時，發現隨水體石油類含量升高，毛蚶對石油烴的BCF減小，且水體石油類含量越高，BCF的減小越緩慢。王曉玲等[31]在研究紫貽貝對重金屬鎘的生物富集特征時，同樣也發現BCF隨暴露劑量增加而逐漸減小，均與本實驗結果呈相似的規律。隨著暴露時間的延長和暴露劑量的升高，大菱鲆蓄積能力受到一定影響，其各組織對呋喃唑酮不能一直維持高蓄積速度，而是具有一定的蓄積平衡點和極限性。BCF隨暴露劑量的升高而下降，這可能與大菱鲆自身的代謝機能存在一定關系，即高劑量呋喃唑酮暴露條件下說明大菱鲆要把蓄積到體內的呋喃唑酮排出體外需要更長的時間，而機體為了避免一定程度的損傷，首先要通過自身調控降低體內對呋喃唑酮的蓄積速度。已有研究表明，水生動物在一定程度有機物影響下，可以明顯提高自身抗氧化酶等指標的活性降低污染物及其代謝物對其造成的損傷[32]。

越來越多的研究表明，畜牧業和水產養殖業中使用硝基呋喃類藥物等抗生素后，會進入土壤、沉積物、地表水等環境中，進而通過水源和飼料對養殖水產品的質量安全產生影響，并進一步對人類的食用安全和健康造成潛在威脅[3,6,26]。Radovnikovic等[22]對愛爾蘭成年人、青少年和兒童3 個不同組開展硝基呋喃類代謝物食用安全暴露風險評估，并在其食用的動物源性食品中檢出了硝基呋喃類代謝物殘留。因此，開展養殖環境和投入品中抗生素污染的風險預警，建立評估模型，用于指導養殖生產實踐，對于保障水產品質量安全具有非常重要的意義。

2.5 數據模型分析

采用MetLab軟件對呋喃唑酮藥物不同添加量、不同富集時間下，AOZ在大菱鲆肌肉組織中的殘留量分別進行線性擬合和二次非線性擬合，其中，線性擬合結果見圖4，表達式見式（2）：

圖4 肌肉組織線性擬合結果Fig. 4 Linear fitting result of AOZ residue in muscle

式中：c為肌肉組織中AOZ殘留量/（μg/kg）；x為飼料中藥物添加量/（mg/kg）；y為富集時間/d。

二次非線性擬合結果見圖5，表達式見式（3）：

圖5 肌肉組織二次非線性擬合結果Fig. 5 Quadratic nonlinear fitting result of AOZ residue in muscle

式中：c為肌肉組織中AOZ殘留量/（μg/kg）；x為飼料中藥物添加量/（mg/kg）；y為富集時間/d。

和方差（sum of squares due to error，SSE）和確定系數R2是評價模型的兩個重要指標。其中，SSE是指擬合數據和原始數據對應點誤差的平方和，SSE越接近于0，說明模型選擇和擬合越好，數據預測越成功。R2是通過數據的變化表征擬合情況，其正常取值范圍為0～1，越接近1，表明這個模型對數據擬合越好。

通過比較線性擬合結果和二次非線性擬合結果可知，SSE2＜SSE1，因此，采用二次非線性擬合結果建立模型，對數據的擬合度更好，本實驗選擇二次非線性擬合方式。

歐盟委員會法規Council Regulation No. 2377/90將呋喃唑酮列為A類禁藥，規定在食品中不得檢出呋喃唑酮，并規定了基準實驗室的檢出限不大于1.0 μg/kg。日本2006年實施的食品中農業化學品殘留“肯定列表制度”，規定硝基呋喃類代謝物的限量要求為1.0 μg/kg。 我國水產品質量安全例行監測（風險監測）（農質發[2021]1號）和產地水產品獸藥殘留監控計劃（農漁發[2021]8號）中硝基呋喃類代謝物的判定限量值為1.0 μg/kg。

當AOZ在肌肉組織中的殘留量不小于1.0 μg/kg時，假設富集30 d，采用二次非線性擬合模型計算可知，飼料中的添加量為0.68 mg/kg。即當飼料中呋喃唑酮的添加量不小于0.68 mg/kg時，連續投喂30 d，大菱鲆肌肉組織中AOZ殘留量不小于1.0 μg/kg。

采用MetLab軟件對呋喃唑酮藥物不同添加量、不同富集時間下，AOZ在大菱鲆皮組織中的殘留量進行二次非線性擬合（圖6），表達式見式（4）：

圖6 魚皮組織二次非線性擬合結果Fig. 6 Quadratic nonlinear fitting results of AOZ residue in skin

式中：c為魚皮組織中AOZ殘留量/（μg/kg）；x為飼料中藥物添加量/（μg/kg）；y為富集時間/d。

當AOZ在魚皮組織中的殘留量不小于1.0 μg/kg時，假設富集30 d，采用二次非線性擬合模型計算可知，飼料中的添加量為0.46 mg/kg。即當飼料中呋喃唑酮添加量不小于0.46 mg/kg時，連續投喂30 d，在大菱鲆魚皮組織中AOZ殘留量不小于1.0 μg/kg。

通過模型預測并科學有效地對投入品進行監控，可以減少養殖過程的帶入風險，有效保障水產品的食用安全。

3 結 論

本實驗選取大菱鲆作為研究對象，在飼料中以遠低于治療劑量（1 g/kg）的水平添加呋喃唑酮，測定大菱鲆體內呋喃唑酮代謝物AOZ殘留量，確定飼料添加量與AOZ殘留量關系、穩態富集時間、組織分布特征和BCF，并構建判別模型預測飼料中呋喃唑酮的含量。實驗結果表明，飼料中低劑量呋喃唑酮藥物污染，會導致大菱鲆體內AOZ殘留。飼料或飼料原料（如魚粉）及養殖投入品引入的硝基呋喃類藥物污染，可能會造成魚體內低含量硝基呋喃類代謝物殘留。此外，硝基呋喃類藥物還具有一定的促生長作用，具有在飼料中長期低添加量添加的潛在風險。目前我國頒布了農業部1486號公告-8-2010和農業部2349號公告-6-2015兩項標準用于測定飼料中硝基呋喃類藥物殘留量，其中1486號公告-8-2010采用高效液相色譜法，其方法檢出限為 0.3 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg，對于飼料中硝基呋喃類藥物低于1.0 mg/kg時，無法準確定量。農業部2349號公告-6-2015采用液相色譜-串聯質譜法，其檢出限 為0.05 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg，相對于高效液相色譜法，采用液相色譜-串聯質譜法具有更高的靈敏度，可以更準確監測飼料污染或是飼料中的非法添加。