消溶穩斑方對ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞炎癥損傷的作用研究*

蔣 靜，邵 靜

1河南中醫藥大學，河南 鄭州450000；2河南中醫藥大學第一臨床醫學院

動脈粥樣硬化是導致多種心腦血管疾病發生、發展的主要病理基礎。冠狀動脈粥樣硬化斑塊的破裂可誘發不穩定心絞痛、急性心肌梗死、猝死等多種心血管危急重癥［1］，對患者生命造成威脅。因此，如何防治動脈粥樣硬化是臨床研究的重點。相關研究［2］發現，炎癥反應誘導的炎癥因子的釋放可促進動脈粥樣硬化斑塊中新生血管的萌發，新生血管的增多會造成動脈粥樣硬化斑塊內環境的失衡，增加斑塊內出血、破裂的可能。另外，炎癥反應也是目前得到普遍認可的導致斑塊不穩定性增加甚至破裂的促發因素［3］。研究證實，單磷酸腺苷酶活化蛋白激酶（amp-activated protein kinas，p-AMPK）/沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是調節機體能量代謝、維持內環境穩態的關鍵調節蛋白［4-5］。AMPK參與調節機體多種炎癥反應信號通路，在氧化還原反應中發揮重要作用。AMPK可以通過反饋調節，調控SIRT1的表達，SIRT1可作用于下游分子通路，干預炎癥反應過程。內皮細胞SIRT1的表達、AMPK的激活可增加抑制炎癥基因編碼，上調組織炎癥因子的釋放水平，最終維持內環境的平穩，抑制氧化應激、抗炎的作用［6］。研究證實［7］，AMPK可通過對SIRT1活性的調節，抑制IKKβmRNA、MMP-9 mRNA的表達上調氧化酶、炎癥因子的釋放閾值，從而減輕炎癥反應促發的不穩定斑塊的破裂，降低不良心血管事件的發生率。本研究通過建立ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞炎癥損傷模型，基于AMPK/SIRT1通路探討消溶穩斑方對人臍靜脈內皮細胞炎癥反應的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物30只雄性SD大鼠，體質量200～250 g，購自河南省實驗動物中心，實驗動物合格證號：SYXK（豫）2017-0006。

1.2 藥物及材料瑞舒伐他汀鈣片［阿斯利康藥業（中國）有限公司，國藥準字J20170008，規格：10 mg/片］；消溶穩斑方（藥物組成：黃芪15 g，葛根15 g，半夏10 g，水蛭10 g，佛手15 g，郁金15 g，地龍15 g，甘松10 g）濃縮成2.1 g/mL的中藥浸膏；人臍靜脈內皮細胞（河南中醫藥大學本院中心實驗室提供，批號：04-400-1A）；高糖DMEM培養基、PBS、胰蛋白酶-EDTA消化液胎牛血清FBS、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、β-actin單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG、Phospho-AMPKα（Thr172）抗體、AMPKα抗體、eECL Western Blot Kit高靈敏度化學發光檢測試劑盒（北京康維世紀生物科技有限公司，批號：CW0049M）；PVDF膜、脫脂奶粉、Tris堿甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺（Life Science公司，批號：LC2007）；RNA提取試劑Trizol Reagent（Invitrogen Life Technologies，批號：15596018）；無酶水（索萊寶，批號R1600）；無水乙醇、異丙醇、氯仿、逆轉錄試劑盒（Invitrogen，批 號：4368814）；SybrGreen Mix kit（Invitrogen，批號：A25742）。

1.3 實驗儀器IX73型倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS）；C170型CO2培 養 箱（德 國Binder）；ST16R型離心機（北京雷勃爾）；BCD-233GB型冰箱（青島海爾股份有限公司）、ULT-1386-3型超低溫冷凍柜（美國REVCO公司）；37℃恒溫培養箱（北京福意電器有限公司）；CF16RXⅡ低溫高速離心機（日立）；全波長掃描式多功能讀數儀（Thermo fisher）；DYY-6C型電泳儀、BIO-RAD Mini-TRANSBLOT CELL、DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳槽、TS-1脫色搖床（太倉市實驗設備廠）；LAS-4000 MINI型生物分子成像儀（日本富士）；ABI 7500型實時熒光定量PCR儀（北京眾力挽生物科技有限公司）；Nanodrop 2000型核酸蛋白濃度微量測定儀（Thermo）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及藥物干預 將30只雄性SD大鼠隨機分為3組，對照組15只，他汀組5只，消溶穩斑方組10只，普通喂養3天后，于第4天開始灌胃。消溶穩斑方組按成人用藥量的10倍給藥，他汀組按成人用藥量的5倍給藥，對照組予蒸餾水灌胃。各組每日灌胃2次，連續3天。于末次給藥1 h后，向腹腔注射10%的水合氯醛（0.3 mL/100 g），待麻醉成功后進行腹主動脈取血。每只大鼠取動脈血約8～10 mL，離心半徑10 cm，3000 r/min離心15 min，取上層血清，置于恒溫水浴鍋中56℃、30 min水浴滅活處理。將滅活的血清用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，然后分裝成2 mL/管，標記后放入-20℃冰箱備用。

1.4.2 人臍靜脈內皮細胞的培養 將凍存管中的人臍靜脈內皮細胞復蘇，將細胞懸液放入離心管離心后，倒掉上清液，將細胞團塊打散，加入完全培養基（10%FBS+90%DMEM混合液），置于37℃的5% CO2培養箱中培養，取第三代細胞備用。

1.4.3 細胞分組及藥物干預 選擇培養的第三代人臍靜脈內皮細胞，將其分為空白組，模型組，他汀組，中藥低、中、高濃度組，中藥中濃度+抵抗素組。空白組用含10%正常大鼠血清+90% DMEM；模型組用含ox-LDL（100 mg/L）+10%正常大鼠血清+90%DMEM；他汀組用含ox-LDL（100 mg/L）+10%瑞舒伐他汀大鼠血清+90%DMEM；中藥低濃度組用含ox-LDL（100 mg/L）+10%中藥低濃度大鼠血清+90%DMEM；中藥中濃度組用含ox-LDL（100 mg/L）+10%中藥中濃度大鼠血清+90%DMEM；中藥高濃度組用含ox-LDL（100 mg/L）+10%中藥高濃度大鼠血清+90%DMEM；中藥中濃度+抵抗素組用含ox-LDL（100mg/L）+10%中藥中濃度大鼠血清+抵抗素50 ng/mL+90%DMEM。將分組后的細胞于37℃的5%CO2培養箱中靜置24 h。

1.5 觀察指標

1.5.1 采用Western Blot法測定p-AMPK、SIRT1水平 將藥物干預24 h的細胞取出，吸除培養基，用PBS（4℃）洗2遍，加入適量組織蛋白裂解液后提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳分析，電泳（8 V/cm，進入分離膠后提至15 V/cm）后行蛋白質轉膜，待轉膜結束后，將標記過的PVDF膜放在封閉液中室溫振搖封閉2 h。棄去封閉液，分別用內參蛋白和目的蛋白的一抗進行雜交，于4℃中反應過夜。取出PVDF膜，TBST漂洗，以HRP標記的山羊抗兔IgG做為二抗，室溫下振搖反應1 h。取出PVDF膜，TBST漂洗，在濾紙上瀝干液體。把PVDF膜浸入發光液中室溫孵育3 min，進行曝光照相。

1.5.2 采用熒光定量RT-PCR法檢測IKKβmRNA、MMP-9 mRNA含量 取100 mg人臍靜脈內皮細胞，加入Trizol試劑1 mL，按照產品說明提取總RNA。然后將RNA逆轉錄為cDNA，具體參照逆轉錄試劑盒說明進行，引物序列見表1。將反轉錄實驗獲得的cDNA溶液10倍稀釋，進行反應液配置，然后在ABI 7500 Fast上進行Real Time PCR反應。MMP-9反應條件：94℃，5 min，然后進入PCR循環，94℃預變性30 s，分別于60℃和58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環33次后再延伸5 min。IKKβ反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行40個循環，72℃充分延伸5 min，4℃保存。取PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，然后在凝膠成像系統上掃描，測定各目的基因吸光度值，分別計算其比值，以目的條帶吸光度比值進行半定量分析。

表1 引物序列

1.6 統計學方法采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，多組間比較采取單因素方差分析，若方差齊則采取L-S-D檢驗，方差不齊則采用Dunnett’T3檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p-AMPK、SIRT1蛋白水平1）p-AMPK水平：與空白組比較，模型組，他汀組，中藥低、中濃度組p-AMPK水平均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；中藥高濃度組、中藥中濃度+抵抗素組p-AMPK水平雖有降低趨勢，但組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，他汀組，中藥低、中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組p-AMPK水平均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與他汀組比較，中藥低濃度組p-AMPK水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；中藥中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組p-AMPK水平升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。2）SIRT1水平：與空白組比較，模型組，中藥低、中濃度組SIRT1蛋白水平均降低（P＜0.05），其余各組SIRT1蛋白水平有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，他汀組，中藥低、中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組SIRT1水平均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與他汀組比較，中藥低、中濃度組SIRT1蛋白水平降低差異有統計學意義（P＜0.05），中藥高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組SIRT1蛋白水平雖較瑞舒伐他汀組升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

表2 各組細胞p-AMPK、SIRT1蛋白水平比較（±s）

表2 各組細胞p-AMPK、SIRT1蛋白水平比較（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，P＜0.05；○表示與他汀組比較，P＜0.05

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圖1 各組細胞p-AMPK、STRI1蛋白表達

2.2 IKKβmRNA、MMP-9 mRNA表達量1）IKKβmRNA的表達：與空白組比較，模型組、中藥低濃度組IKKβmRNA表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05），余治療組與空白組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，他汀組，中藥低、中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組IKKβmRNA表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。與他汀組比較，中藥低濃度組IKKβmRNA表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；中藥中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組IKKβmRNA表達水平升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。2）MMP-9 mRNA的表達：與空白組比較，模型組、中藥低濃度組MMP-9 mRNA表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05），余治療組MMP-9 mRNA的表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，他汀組，中藥低、中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組MMP-9 mRNA表達水平均降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。與他汀組比較，僅中藥低濃度組MMP-9 mRNA表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組細胞IKKβ mRNA、MMP-9 mRNA表達水平比較（±s）

表3 各組細胞IKKβ mRNA、MMP-9 mRNA表達水平比較（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；△表示與模型組比較，P＜0.01；○表示與他汀組比較，P＜0.05

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3 討論

動脈粥樣硬化屬于中醫學中“脈痹”范疇。筆者結合多年診治動脈粥樣硬化性疾病的臨床經驗，以“益氣活血，化瘀通絡”為法，自擬消溶穩斑方［8］。消溶穩斑方［9］由黃芪、葛根、水蛭、地龍、佛手、郁金、半夏、甘松諸藥配伍而成。方中重用黃芪為君，氣為血之帥，氣行則血行，血行則血脈得通，血瘀得化［10］；葛根與黃芪為伍，共為君藥，使補而不燥，化生有源［11］。水蛭、地龍為臣藥，水蛭功善破血逐瘀，地龍走竄通絡，二者助君藥通絡行血，脈痹自除；佛手、郁金為佐藥，二者寬中理氣，行氣解郁，調暢氣機；半夏為佐藥，取其祛痰下氣，化痰散結之功；甘松亦為使藥，性甘溫，入心經，有理氣、疏郁、通陽之功。此外，甘松尚有醒脾導滯，行氣降逆之能，故使補而不壅，寓疏于補。諸藥合用，使血行瘀得以化，氣行郁得以疏，氣血調和，血脈自通，脈痹自除。

SIRT1是一種NAD+依賴性組蛋白去乙酰化酶，與AMPK之間存在反饋調節機制，因此，它可通過激活AMPK，增強AMPK對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的負調控，抑制炎癥基因IKKβ mRNA、MMP-9 mRNA復制，上調炎癥因子釋放閾值，減輕氧化應激、炎癥反應［12］。研究發現［13］，動脈粥樣硬化患者的血管內皮細胞表面存在的NADPH氧化酶亞基水平上升，而降低NADPH氧化酶活性則可降低氧化應激水平，進而緩解高脂、炎癥等引起的血管內皮細胞損傷。研究證實，炎癥損傷，可激活組織細胞中AMPK蛋白，轉變為磷酸化的AMPK，而p-AMPK水平升高后則會上調位于其下游的調控蛋白SIRT1蛋白的表達［14］，同時SIRT1蛋白表達的增加可催化轉錄因子核因子（nuclear factor-κB，NF-κB）去乙酰化反應而降低其活性，抑制炎癥相關基因IKKβ mRNA、MMP-9 mRNA的轉錄，從而減少炎性因子的釋放［15］。

本研究發現，消溶穩斑方可通過作用于AMPK/SIRT1信號通路，激活AMPK使其磷酸化，同時通過正反饋上調SIRT1水平，增加p-AMPK及SIRT1的水平來發揮抑制動脈粥樣硬化斑塊及損傷內皮細胞中的炎癥基因IKKβmRNA、MMP-9 mRNA的表達［16］，發揮抑制炎癥反應、氧化應激損傷的用，從而減少炎癥反應導致的人臍靜脈內皮細胞損傷，降低動脈粥樣硬化斑塊形成的風險。