不同花粉授粉對溫州蜜柑種子形成的影響

黃秀， 柯甫志， 孫立方， 王平， 聶振朋， 徐建國， 孫建華

(浙江省柑橘研究所 國家柑橘品種改良浙江分中心，浙江 臺州 318026)

柑橘是世界上栽培面積最大、產量最高的水果，也是我國第一大水果作物[1]。柑橘以其濃郁的風味和豐富的營養價值深受消費者的喜愛，隨著我國經濟的發展以及國民消費水平的提高，對柑橘的品質及品種多樣性提出了更高的要求，柑橘品種的更新顯得尤為重要。溫州蜜柑是浙江省主栽的柑橘品種之一，改良溫州蜜柑現有品種，選育出更早熟、含糖量高的溫州蜜柑新品系一直是浙江柑橘育種的主要目標。通過珠心苗選育新品種是溫州蜜柑育種的重要途徑，但溫州蜜柑類因雄性不育一般表現無核，自然狀態很難形成種子[2]，給新品種選育工作增加了難度。為培育溫州蜜柑珠心苗，本實驗選用溫州蜜柑品系由良(CitrusunshiuYura)為母本，由良屬于早熟溫州蜜柑類，由宮川芽變選育而來[3-4]，是近幾年浙江省主要推廣的品種之一，具有高糖、化渣、易剝皮、成熟期早等特性。采用有性雜交的方法，利用不同品種的花粉對由良進行授粉，培育一批由良溫州蜜柑的珠心苗和雜交后代群體，并對不同授粉組合的果實坐果率、結籽率、種子發育等情況進行統計分析，研究不同品種花粉授粉對溫州蜜柑結籽的影響，進而篩選出一種獲取溫州蜜柑后代群體的有效方法，加快溫州蜜柑育種進程，培育出更多符合市場需求的新品種。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗在浙江省柑橘研究所試驗站種植園進行，以樹齡4 a的由良溫州蜜柑為母本，父本為雞尾葡萄柚(CitrusparadisiMacf)、四季柚(Citrusgrandis(Linn) Osbeck)、日本夏橙(2倍體)(CitrusnatsudaidaiHayata)和4倍體日本夏橙(CitrusnatsudaidaiHayata)。父本花粉取自浙江省柑橘研究所種質資源圃，用4種花粉分別對由良母本進行授粉。授粉組合為：由良×雞尾葡萄柚；由良×四季柚；由良×日本夏橙；由良×4倍體日本夏橙；以花朵自然開放未處理的母本樹為對照組，簡稱為CK。

1.2 雜交授粉

于2020年4月8日采集4種父本花粉。選擇即將要開放的花苞帶回實驗室，用鑷子將雄蕊取出放在培養皿中，置于25～28 ℃的環境下烘干，然后貯存在2 mL離心管中備用。4月10日在母本盛花期進行授粉，選大小、花量、長勢相似的15棵由良母本樹，每棵樹授粉200～300朵花，每棵樹為一個生物學重復，每個雜交組合設置3個生物學重復。選擇花苞大但未開放的花朵，用棉簽蘸取準備好的花粉輕輕涂抹在柱頭上進行授粉，將雜交枝條上已經開放和未授粉的花朵摘除，統計授粉花朵數。授粉當天噴施50 mg·kg-1赤霉素保花，并套好玻璃紙袋，1周后將玻璃紙袋去掉。在第1次生理落果之前再次噴施50 mg·kg-1赤霉素保果，之后田間管理同日常。

1.3 I2-KI溶液染色法檢測花粉活力

I2-KI溶液的配制：稱取2 g KI溶于10 mL超純水中，加入1 g I2，攪拌至完全溶解后定容至300 mL，存貯在棕色瓶中備用。

花粉活力測定：取1粒雜交授粉所用花粉的花藥置于載玻片上，加1滴超純水，用鑷子將花藥搗碎釋放出花粉粒，再加2滴I2-KI溶液，小心蓋上蓋玻片，在電子顯微鏡下觀察。同一視野下統計出藍色和黃褐色的花粉粒數，1張片子查看5個不同視野，每個品種查看4張玻片，凡是被I2-KI溶液染成藍色的為含有淀粉、活力較強的花粉粒，染成黃褐色的為發育不良的花粉粒。

1.4 雜交果實的處理

在2020年9月27日果實成熟時將雜交果實采摘帶回實驗室進行數據采集，統計每個雜交組合所獲得的雜交果數。每個生物學重復隨機選取30個果實，記錄每個果實的單果重、可食率、縱徑、橫徑、種子數，觀察種子發育情況。單果種子數=種子總數/果實總數，果形指數=縱徑/橫徑。種子發育情況分為3類：1) 飽滿：種子發育完全，胚乳飽滿；2) 干癟：種子發育一般，胚乳半飽滿；3) 退化：種皮存在，胚乳基本敗育或完全消失，具體情況如圖1所示。

圖1 種子發育的情況分類

1.5 數據處理

采用Excel 2016進行數據統計和整理，采用Sigmplot軟件進行數據處理，數據分析方法選用新復極差法。

2 結果與分析

2.1 不同品種的花粉活力

由表1可知，不同品種花粉活力不同，4倍體日本夏橙花粉活力最強，為72.68%；其次是日本夏橙、四季柚和雞尾葡萄柚，分別為67.15%、61.47%和61.31%。分析得出，4倍體日本夏橙與日本夏橙相比花粉活力差異不顯著，與雞尾葡萄柚和四季柚差異達到顯著水平；日本夏橙、雞尾葡萄柚和四季柚的花粉活力差異未達到顯著性水平。雞尾葡萄柚和日本夏橙標準誤較大，分別為5.57和3.48，說明其花粉個體間活力差異較大。

表1 不同品種花粉的活力差異

2.2 不同花粉授粉對由良果實坐果率的影響

不同品種花粉對由良授粉，果實坐果率差異明顯(表2)。自然狀態下對照組由良果實坐果率為23.37%；其余4個處理組，由良×雞尾葡萄柚組合的坐果率較高，達到38.17%，與對照比較達到極顯著差異；其次是由良×日本夏橙和由良×四季柚，坐果率分別為36.78%和33.40%，均極顯著高于對照；由良×4倍體日本夏橙組合的坐果率最低，僅有24.52%，與對照差異不顯著。總體來說，雞尾葡萄柚、日本夏橙和四季柚花粉對由良授粉均能極顯著提高果實坐果率，雞尾葡萄柚授粉果實坐果率提升效果最好，4倍體日本夏橙授粉對由良果實坐果率影響不顯著。

表2 不同花粉授粉對果實坐果率的影響

2.3 不同花粉授粉對由良種子形成的影響

不同花粉授粉對由良果實結籽情況影響不同(表3)。在5個組合中，由良×雞尾葡萄柚組合獲得的種子數最多，達到149粒；其次是由良×日本夏橙組合，101粒；再次是由良×四季柚組合，64粒；由良×4倍體日本夏橙組合的果實結籽較少，為32粒；對照組未得到種子。單果種子數從高至低依次為：由良×雞尾葡萄柚組合、由良×日本夏橙組合、由良×四季柚組合、由良×4倍體日本夏橙組合、對照組。由良×雞尾葡萄柚組合的單果種子數與由良×四季柚組合、由良×4倍體日本夏橙組合以及對照組相比，差異達到極顯著水平；由良×日本夏橙和由良×四季柚組合單果種子數顯著高于對照；由良×4倍體日本夏橙組合與對照差異不顯著。所有組合種子胚性均為多胚。總的來說，由良在常規自然雜交條件下基本無種子形成，采用雞尾葡萄柚花粉對由良授粉所得種子數最多，單果種子數最高。

表3 不同花粉授粉對由良種子形成的影響

2.4 不同花粉授粉對種子發育情況的影響

從表4和圖2可知，不同雜交組合對種子發育情況影響不同。對照組沒有得到種子，在其余4組中，由良×四季柚組合所得種子的飽滿率最高，為63.49%；其次是由良×日本夏橙組合和由良×雞尾葡萄柚組合，分別為61.56%和51.74%；由良×4倍體日本夏橙組合的種子飽滿率最低，為6.67%。分析得出，由良×四季柚組合、由良×日本夏橙組合以及由良×雞尾葡萄柚組的種子飽滿率極顯著高于對照組和由良×4倍體日本夏橙組合；由良×四季柚組合、由良×日本夏橙組合以及由良×雞尾葡萄柚組合之間差異不顯著性；對照組與由良×4倍體日本夏橙組合相比差異未達到顯著水平。不同授粉組合對種子干癟率的影響不同，由良×4倍體日本夏橙組合和由良×四季柚組合種子干癟率最低，分別為2.78%和9.79%，兩者相比差異不顯著；由良×日本夏橙組合種子的干癟率為20.19%，由良×雞尾葡萄柚組合的種子干癟率最高，為36.65%；雞尾葡萄柚組合和夏橙組合種子干癟率較高，可能與花粉個體間活力差異較大有關。

表4 不同花粉授粉對種子發育的影響

圖2 不同花粉授粉所得的種子

不同授粉組合種子退化率，由低到高依次為：對照<由良×雞尾葡萄柚<由良×日本夏橙<由良×四季柚<由良×4倍體日本夏橙。由良×4倍體日本夏橙組合種子退化率極顯著高于其他3個組合，這可能與2倍體由良與4倍體花粉雜交產生3倍體種子，而3倍體種子多敗育有關，由良×4倍體日本夏橙組中有極少數飽滿種子，這部分種子可能是由良珠心細胞受4倍體日本夏橙花粉刺激產生的珠心胚；由良×雞尾葡萄柚與由良×四季柚組合種子退化率差異顯著；由良×雞尾葡萄柚與由良×日本夏橙以及由良×四季柚與由良×日本夏橙間差異均未達到顯著水平。總的來說，用雞尾葡萄柚、日本夏橙和四季柚花粉對由良進行授粉獲得的種子發育情況較好，4倍體日本夏橙花粉對由良授粉種子多退化敗育。

2.5 不同花粉授粉對果實品質的影響

表5所示，由良×4倍體日本夏橙組合果實的單果重、果皮重、果皮厚在5組組合中均最高，其余組合從高至低依次為由良×日本夏橙、由良×四季柚、對照、由良×雞尾葡萄柚。雖然各組合果實可食率略有差異，但差異未達到顯著性水平。果形指數從高到低依次為：由良×雞尾葡萄柚、由良×4倍體日本夏橙、由良×日本夏橙、由良×四季柚、對照。總體來說，授粉種子數多的組合，單果重和果皮重下降、果皮變薄，果形指數上升，可能因為雞尾葡萄柚、四季柚花粉授粉提升了由良果實坐果率，使單個果實質量下降；4倍體日本夏橙組果實坐果率低，單個果實質量上升。

表5 不同花粉授粉對果實品質的影響

3 討論

較多研究表明，異花授粉能影響果實坐果率。如藍云龍等[5]研究不同品種花粉對翡翠柚授粉，不同程度的提高了果實坐果率。王紹華等[6]的研究同樣得到異花授粉能提高水晶柚坐果率。本試驗采用雞尾葡萄柚、四季柚、日本夏橙和4倍體日本夏橙4種花粉對由良進行授粉，結果得到雞尾葡萄柚、四季柚、日本夏橙花粉授粉均不同程度提高由良果實坐果率。異花授粉提高由良果實的坐果率，可能是因為人工授粉增加了柱頭上附著的花粉數量，使果實的種子數增加，進而影響了果實內各種激素含量和激素間的比例[7-10]，從而提高了果實的坐果率，本研究中結籽率高的授粉組合果實坐果率也高，也相應的說明了這一點。本試驗4倍體日本夏橙花粉授粉對由良果實坐果率影響不顯著，可能是因為由良(2倍體)與4倍體日本夏橙花粉雜交產生3倍體，種子少，且多敗育，對果實內各激素含量的影響程度低有關。

雞尾葡萄柚、四季柚、夏橙均為2倍體花粉，3個品種花粉活力差異不顯著，對由良進行授粉每個雜交組合果實結籽率和坐果率存在差異，其中以雞尾葡萄柚花粉授粉所得果實結籽率和坐果率均最高，說明溫州蜜柑品系由良結籽和坐果情況受父本品種影響較大。雞尾葡萄柚花粉對由良授粉得到的種子總數在所有組合中最多，但種子的干癟率亦較高，這可能與雞尾葡萄柚花粉活力個體間差異較大有關。

從4種花粉對由良授粉以及自然雜交組合中獲得果實的單果種子數和坐果率等方面考慮，本研究結果表明，對于雄性不育的溫州蜜柑品系，為獲得更多種子用于珠心苗培育，宜選用同為2倍體的雞尾葡萄柚花粉進行授粉。