EGCG對急性熱應激肉雞抗氧化能力的影響

張 成 趙 菲 李 煬 張 勇 王 馳 耿照玉

(安徽農業大學 動物科技學院，合肥 230036)

環境溫度驟然升高而引發的熱應激現象引起了家禽生產者的普遍關注。家禽受到急性熱應激時會使器官受損，進而導致生理機能紊亂，最終影響家禽正常生長發育和健康，造成較大的經濟損失[1-2]。研究表明，熱應激狀態下，家禽抗氧化系統失衡，導致機體內活性氧自由基(ROS)增高，誘發機體發生氧化應激損傷[3]。因此，研究如何減少熱應激對肉雞的氧化損傷顯得尤為重要。研究顯示，飼糧中添加具有抗氧化活性的植物源活性物質是緩解熱應激肉雞氧化應激損傷的有效途徑[4]，其中多酚類物質表現效果很佳[5-8]。茶多酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌以及清除自由基等多種生物學功能，其主要成分為兒茶素，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)占兒茶素80%[9]。研究表明，EGCG可降低細胞內ROS及脂質過氧化水平，提高細胞內谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，表明EGCG有顯著的抗氧化效果[10]。Wada等[11]研究表明，EGCG可以提高小鼠胰島細胞的活力和抗氧化功能，可能與其提高核因子E2相關因子2(Nrf2)和亞鐵血紅素加氧酶1(HO-1)mRNA的表達量并減少ROS的生成有關。韓國清等[12]在仔豬日糧中添加EGCG顯著提高了仔豬的采食量和血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低血清丙二醛(MDA)含量，表明EGCG能緩解仔豬斷奶后的氧化應激，提高生產性能。熱應激的時長、溫度高低及模式(持續和循環)對家禽抗氧化系統的影響存在差異[3]。研究表明，慢性熱應激條件下，飼糧中添加EGCG通過提高肉雞血清和肝臟GSH-Px、SOD和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性，降低MDA水平來改善肉雞生長性能并減輕應激損傷，同時提高肝臟中Nrf2蛋白的表達水平[13-14]，提示EGCG提高慢性熱應激肉雞抗氧化能力可能介導了Nrf2信號通路，但其具體機制仍需進一步探究。然而關于EGCG對急性熱應激肉雞抗氧化能力的影響還未有相關研究，如何改善急性熱應激肉雞的抗氧化能力，其具體機制是否與Nrf2信號通路介導相關，值得進一步研究。因此，本研究以淮南麻黃肉雞為研究對象，旨在考察飼糧中添加EGCG對急性熱應激肉雞抗氧化能力的影響并初步探究其機理，以期為其作為綠色、安全的飼料添加劑應用于家禽生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取10日齡體重(170±2) g的淮南麻黃公雞144羽，隨機分為3組：對照組(Ⅰ組)、急性熱應激組(Ⅱ組)、急性熱應激+EGCG組(Ⅲ組)，每組6個重復，每個重復8羽。Ⅰ組和Ⅱ組飼喂基礎飼糧，Ⅲ組飼喂在基礎飼糧中添加400 mg/kg EGCG的試驗飼糧。10～21日齡，環境溫度由30 ℃降溫至(22±1) ℃，隨后保持該溫度至93日齡。94日齡時，Ⅰ組環境溫度維持為(22±1) ℃，Ⅱ組和Ⅲ組環境溫度升高到(33±1) ℃，維持該溫度12 h并禁食，熱應激處理后屠宰取樣。雞舍用排風扇進行縱向通風，用加濕器控制濕度(相對濕度65%左右)，用加熱器控制溫度。

1.2 飼養管理

試驗在安徽農業大學試驗基地開展，試驗雞自由采食和飲水，常規管理。基礎飼糧參照《雞飼養標準》(NY/T 33-2004)配制，基礎飼糧組成及營養成分見表1。EGCG純度為98%，購自杭州怡倍嘉茶葉科技有限公司。

表1 飼糧組成與營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets (air-dry basis)

1.3 樣品采集

在每個重復中隨機選取體重相近的2羽肉雞，翅靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心15 min，分離血清，置于-20 ℃保存待測。采血后，頸靜脈放血處死后，迅速打開腹腔，采取肝臟、脾臟、空腸樣品，裝于無菌的凍存管并液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.4 檢測指標

1.4.1器官指數的測定

取肝臟、肌胃、脾臟、十二指腸、空腸、回腸稱重，計算器官指數。

肝臟指數=肝臟質量/體重
肌胃指數=肌胃質量/體重
脾臟指數=脾臟質量/體重
十二指腸指數=十二指腸質量/體重
空腸指數=空腸質量/體重
回腸指數=回腸質量/體重

1.4.2血清和組織器官中抗氧化指標測定

血清和組織器官中CAT、GSH-Px、總SOD(T-SOD)活力以及蛋白羰基(PC)和MDA含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒按照說明書進行測定。組織樣品制備過程如下：稱取空腸、肝臟和脾臟樣品(0.5～1.0 g)，按質量(g)∶體積(mL)=1∶9 的比例加入預冷的生理鹽水，在冰浴條件下用勻漿機勻漿，然后于4 ℃冷凍離心機中3 500 r/min離心10 min，取上清液進行測定。采用的儀器為SUNRISE酶標儀和TU-1900紫外可見光分光光度計。

1.4.3肝臟中Nrf2通路相關基因表達測定

采用上海Yeasen生物技術公司的Trizol試劑提取肝臟總RNA，用Nano-drop 2000分光光度計在260和280 nm處測定吸光度值，進行RNA純度檢測。檢測合格后反轉錄成cDNA。利用NCBI搜索目標基因序列，運用Primer 5進行引物設計，引物由安徽通用生物科技有限公司合成。基因表達水平用ABI 7500實時定量PCR儀進行測定。qRT-PCR 反應體系為20 μL：cDNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，PCR Master Mix(2×)10 μL，ddH2O 6 μL。選擇β-肌動蛋白(β-actin)作為內參基因，使用2-ΔΔCt方法計算目的基因的表達量。引物序列及參數見表2。

表2 Nrf2信號通路相關基因的引物序列Table 2 Primers sequences for Nrf2 signaling pathway-related genes

1.5 數據處理與統計分析

試驗數據以平均值±標準誤表示，使用SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著作為判斷標準。

2 結果與分析

2.1 EGCG對急性熱應激肉雞器官指數的影響

由表3可見，急性熱應激和EGCG對肝臟指數、肌胃指數、十二指腸指數、空腸指數和回腸指數均無顯著影響(P>0.05)。然而，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞脾臟指數顯著下降(P<0.05)，提示急性熱應激損害了肉雞的器官免疫功能。

表3 EGCG對急性熱應激肉雞器官指數的影響Table 3 Effects of EGCG on organ index of acute heat-stressed broilers g/kg

2.2 EGCG對急性熱應激肉雞血清抗氧化功能的影響

由表4可見，盡管急性熱應激和EGCG對血清中MDA、PC含量和GSH-Px活力均無顯著影響(P>0.05)，但與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞血清中MDA和PC含量分別提高了77.19%和25.14%(P<0.10)；與Ⅱ組相比，Ш組肉雞血清中MDA和PC含量分別降低了42.57%和21.19%。另外，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞血清中T-SOD和CAT活力顯著降低(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ш組肉雞血清中CAT和GSH-Px活力分別提高了48.87%和20.13%(P<0.10)。上述結果提示，EGCG可提高急性熱應激肉雞機體的抗氧化功能。

表4 EGCG對急性熱應激肉雞血清抗氧化功能的影響Table 4 Effects of EGCG on antioxidant function in serum of acute heat-stressed broilers

2.3 EGCG對急性熱應激肉雞脾臟抗氧化功能的影響

由表5可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞脾臟中T-SOD 和CAT活力顯著降低(P<0.05)；與Ⅱ組相比，飼糧中添加EGCG可顯著提高急性熱應激肉雞脾臟中CAT活力(P<0.05)，提示EGCG對急性熱應激肉雞脾臟抗氧化活力有顯著的提高效果。

表5 EGCG對急性熱應激肉雞脾臟抗氧化功能的影響Table 5 Effects of EGCG on antioxidant function in spleen of acute heat-stressed broilers

2.4 EGCG對急性熱應激肉雞空腸抗氧化功能的影響

由表6可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞空腸中MDA含量顯著上升(P<0.05)；與Ⅱ組相比，飼糧中添加EGCG可顯著降低急性熱應激肉雞空腸中MDA含量(P<0.05)，表明EGCG能降低急性熱應激肉雞空腸的氧化損傷。

表6 EGCG對急性熱應激肉雞空腸抗氧化功能的影響Table 6 Effects of EGCG on antioxidant function in jejunum of acute heat-stressed broilers

2.5 EGCG對急性熱應激肉雞肝臟抗氧化功能的影響

由表7可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞肝臟中T-SOD和GSH-Px活力顯著降低(P<0.05)，MDA和PC含量極顯著上升(P<0.01)；與Ⅱ組相比，飼糧中添加EGCG可顯著提高急性熱應激肉雞肝臟中GSH-Px活力(P<0.05)，同時極顯著降低MDA含量(P<0.01)。上述結果提示，EGCG對急性熱應激肉雞肝臟的抗氧化能力有顯著的提高效果。

表7 EGCG對急性熱應激肉雞肝臟抗氧化功能的影響Table 7 Effects of EGCG on antioxidant function in liver of acute heat-stressed broilers

2.6 EGCG對急性熱應激肉雞肝臟Nrf2信號通路中關鍵基因表達的影響

由表8可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞肝臟中Nrf2、CAT和NQO1mRNA表達量顯著降低(P<0.05)，GSH-PxmRNA表達水平極顯著降低(P<0.01)，而Keap1mRNA表達量顯著升高(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組肉雞肝臟中CATmRNA表達量顯著升高(P<0.05)。上述結果提示EGCG提高急性熱應激肉雞肝臟抗氧化能力可能介導了Nrf2信號通路。

表8 EGCG對急性熱應激肉雞肝臟Nrf2信號通路相關基因表達的影響Table 8 Effects of EGCG on the expression of Nrf2 signaling pathway-related genes in liver of acute heat-stressed broiler

3 討 論

3.1 EGCG對急性熱應激肉雞器官指數的影響

器官指數是衡量動物機體系統發育狀況和功能的重要指標。對于家禽而言，脾臟是最為重要的免疫器官，其生長發育是家禽免疫系統功能的基礎[15]。大量研究表明，熱應激會使機體器官發育受阻，免疫器官指數顯著降低，脾臟表現尤甚[16]，這主要是由于熱應激一方面導致了脾臟炎癥的發生，另一方面導致了抗氧化系統受損，最終導致脾臟細胞的凋亡。與此一致，本研究表明，急性熱應激顯著降低了肉雞脾臟指數。Zhang等[6]研究表明，白藜蘆醇(多酚類物質)可顯著降低慢性熱應激對肉雞脾臟等器官指數的負面影響。然而，Aydogan等[17]研究表明，同為多酚類物質的EGCG對正常飼養條件下肉雞肝臟、心臟、脾臟、胰腺和法氏囊指數均無顯著影響。此外，本研究發現，EGCG對急性熱應激肉雞器官指數無顯著影響，但其如何影響慢性熱應激條件下肉雞的器官指數尚需深入研究。

3.2 EGCG對急性熱應激肉雞血清和組織器官抗氧化能力的影響

肉雞對高溫有一定的耐受性，但該能力是有限的，隨著溫度的升高和時間的延長，機體內的氧化還原平衡被破壞，ROS大量聚集并誘導氧化應激，導致細胞脂質、蛋白質和DNA過氧化[18]。血清抗氧化酶的變化反映了動物機體抗氧化能力的改變，而MDA和PC含量反映了機體氧化損傷的程度[19]。前期研究發現，37 ℃的高溫可導致雪峰烏骨雞血清中GSH-Px、CAT等抗氧化酶活性顯著降低，抗氧化能力減弱，脂質發生過氧化反應[5]，而營養調控可有效提高抗氧化酶活性[20]。EGCG的B環上含有活躍的羥基氫，可用于清除自由基，是純天然的高效抗氧化劑。研究表明，EGCG能顯著降低慢性熱應激肉雞血清中MDA含量，顯著升高抗氧化酶CAT、SOD和GSH-Px活性，表明EGCG可通過提高抗氧化酶活性，進而緩解熱應激導致的氧化損傷[13,19]。本研究表明，飼糧中添加EGCG可分別提高急性熱應激肉雞血清中GSH-Px和CAT活力達20.13%和48.87%，同時降低血清中MDA和PC含量達42.57%和21.99%，說明EGCG在一定程度上改善了肉雞機體的抗氧化能力，緩解了急性熱應激引起的氧化應激，但其作用機理需要進一步探究。

熱應激是影響腸道形態和功能的主要因素之一，小腸作為家禽消化吸收營養物質的主要場所，對家禽的生長發育起著至關重要的作用[21]。當家禽處于熱應激狀態下，一方面高溫引起的氧化應激破壞了抗氧化系統[22]，另一方面機體為了加快散熱，會加速血液流向體表，使得流向腸道的血液大大減少，導致腸道供血不足，從而造成腸道細胞的凋亡，壞死甚至脫落等現象，是腸道病變和黏膜損傷的重要原因[23]。雷昕[9]研究發現，飼糧添加EGCG可顯著提高慢性熱應激肉雞空腸中GSH-Px、SOD和CAT活性，同時降低MDA含量，提示其顯著提高了慢性熱應激肉雞空腸抗氧化性能，并降低氧化損傷。本研究表明，急性熱應激和EGCG對肉雞空腸抗氧化酶無顯著影響，但急性熱應激顯著提高了肉雞空腸中MDA含量，而飼糧中添加EGCG可顯著將其降低，說明EGCG可有效降低急性熱應激對肉雞腸道的氧化損傷。

脾臟作為最重要的外周免疫器官，參與細胞和體液免疫過程。Zhang等[6]研究證明，慢性熱應激顯著降低肉雞脾臟中CAT、T-AOC和T-SOD活力，同時顯著提高MDA含量，表明熱應激對肉雞脾臟抗氧化能力有抑制作用，而飼糧添加白藜蘆醇具有顯著的緩解作用。盡管EGCG具有抗氧化作用，但其對熱應激肉雞脾臟抗氧功能的調控作用還未見報道。本研究發現，急性熱應激顯著降低了脾臟中T-SOD和CAT活力，而飼糧中添加EGCG可顯著提高急性熱應激肉雞脾臟中CAT活力，提示其可有效緩解急性熱應激對肉雞脾臟抗氧化功能的負面作用。

肝臟作為動物體內最重要的器官之一，具有代謝和解毒的作用。肉雞分別在35和38 ℃的環境中暴露3 h后，肝臟中MDA和PC的含量顯著升高，表明肉雞暴露于高溫下會導致肝臟脂質和蛋白質的氧化損傷[24]。體外試驗表明，EGCG可提高人體肝細胞SOD活性，同時降低MDA含量，提示其可提高肝細胞抗氧化能力，同時降低氧化損傷[25]。薛菠[14]研究發現，飼糧中添加EGCG可顯著提高慢性熱應激肉雞肝臟中SOD、GSH-Px和CAT的活性，同時顯著降低MDA含量。本研究表明，急性熱應激肉雞肝臟中MDA和PC含量極顯著升高，T-SOD 和GSH-Px活力顯著降低，而飼糧中添加EGCG可極顯著降低急性熱應激肉雞肝臟中MDA含量，同時顯著提高GSH-Px活力，表明EGCG能有效提高急性熱應激肉雞肝臟抗氧化能力，從而緩解急性熱應激對肝臟造成的損傷。可見，EGCG具有良好的護肝作用，能有效緩解急性和慢性熱應激對肉雞肝臟抗氧化功能的損害，緩解肝臟氧化損傷。

3.3 EGCG對急性熱應激肉雞肝臟Nrf2信號通路抗氧化基因表達的影響

大量研究表明，Nrf2作為抗氧化系統中重要的轉錄因子[26-27]，對于維持機體氧化平衡以及調控下游CAT和NQO1等抗氧化酶基因的表達具有至關重要的作用[28-30]。敲除Nrf2基因的小鼠對氧化應激的敏感性增加，而使用激活劑增強Nrf2的表達可在一定程度上保護動物免受氧化損傷。EGCG是綠茶多酚中含有的Nrf2活化劑，Wang等[31]研究表明飼糧中添加EGCG可上調蛋雞子宮Nrf2和HO-1mRNA表達量，從而提高蛋雞的抗氧化能力，緩解釩誘導的氧化應激。薛波[14]研究表明，EGCG可顯著提高慢性熱應激肉雞肝臟中Nrf2蛋白的表達水平。本研究顯示，急性熱應激顯著降低肉雞肝臟中Nrf2、GSH-Px、CAT和NQO1的mRNA表達量，并顯著提高Keap1的mRNA表達量，這可能是急性熱應激導致肉雞發生氧化應激損傷的主要原因，而飼糧中添加EGCG可顯著提高急性熱應激肉雞肝臟中CATmRNA表達量，說明EGCG可能介導激活Nrf2信號通路提高機體抗氧化能力，進而有效緩解急性熱應激導致的氧化損傷。但具體機制尚需進一步研究，后續研究可進一步檢測Nrf2信號通路關鍵蛋白的表達水平，如結果與mRNA水平的結果一致，則可進一步在細胞水平開展研究，基于Nrf2信號通路揭示EGCG緩解肉雞急性熱應激的機制。

4 結 論

飼糧添加EGCG可提高急性熱應激肉雞抗氧化能力，進而緩解急性熱應激造成的氧化損傷，其機制可能與EGCG激活Nrf2信號通路關鍵抗氧化基因表達有關。