中國優秀柔道運動員爆發力敏感基因位點的確定

亓 朔，蘇 浩，許奎元，趙林林，王傳軍，曹建民

柔道項目是一個運動強度極大的非周期過程，具有競爭性與高強度間歇性，需要較高的絕對和相對水平的肌肉力量，要求運動員在4～5 min內多次發動進攻，瞬間完成復雜的技術動作（Franchini et al.，2011）。選材是支撐競技體育國際競爭力的九大支柱之一，也是決定一個國家競技運動水平優劣不可或缺的重要因素（黎涌明等，2018）。我國柔道項目的選材經歷過3個階段，自然選材、經驗選材、科學選材，目前以科學選材為主，主要是結合形態學、身體素質、生理生化、心理等指標進行選材（何鋼等，2015）。

近年，隨著分子遺傳學和基因檢測技術的不斷發展，通過基因技術對優秀運動員進行基因位點篩選，從而為早期運動員的培養提高精準性，提高運動員成才率。

通過在 Pubmed、Web of Science、SPORTDiscus、Med‐line等外文網站搜索“judo”“gene”“explosive force”等關鍵詞確定與爆發力相關的位點作為候選基因位點，位點選擇依據：所選項目特點與柔道項目類似且在國內外研究結果為正相關。一項文獻檢索（1997－2015年）顯示，至少有120個遺傳標記與優秀運動員狀態相關，其中包括77個與耐力相關的遺傳標記和43個與爆發力相關的遺傳標記，值得注意的是，在43個與爆發力相關的遺傳標記中，ACE基因rs4646994位點、ACTN3基因rs1815739位點和PPARα基因rs4253778位點在3項或3項以上的研究中被證明與優秀運動員的爆發力顯著相關（Ahmetov et al.，2015）。因此，以上3個位點可納入本研究的候選基因位點。楊若愚（2017）在對我國優秀運動員爆發力相關基因多態性及其預測模型的研究中發現，ACTN3基因rs1815739、ADBR3基因rs4994、CNTFR基因rs3808871和VDR基因rs7975232位點被證明與中國優秀運動員爆發力存在相關。因此，將ADBR3基因rs4994、CNTFR基因rs3808871和VDR基因rs7975232位點納入本研究的候選基因位點。國外文獻在對CNTFR基因與VDR基因中常選取多個位點進行研究，且結果不一，為保證結果的準確性，將CNTFR基因rs41274853與VDR基因rs2228570位點納入本研究的候選基因位點（Bahat et al.，2010；Bjork et al.，2019；Hong et al.，2014；Massidda et al.，2015；Miyamo‐to-Mikami et al.，2016）。

綜上，本研究選用如下候選基因位點：ACTN3基因rs1815739位點、ADBR3基因rs4994位點、CNTFR基因rs3808871和rs41274853位點、PPARα基因rs4253778位點、VDR基因rs7975232和rs2228570位點及ACE基因rs1799752位點。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

研究對象分為兩組：優秀柔道運動員組與普通組，將54名漢族優秀柔道運動員組成的優秀柔道運動員組命名為J組（165.6±3.7 cm，22.±3.4歲，訓練年限9.63±3.30年），180名漢族普通大學生組成的普通組命名為C組（166.8±4.5 cm，20.4±2.5歲）。J組從國家隊以及地方省隊選取，要求運動員等級為國家健將或國際健將，民族為漢族，C組從北京體育大學本科生中隨機招募，要求無任何專業隊運動訓練經歷，民族為漢族。

1.2 DNA樣本的采集

本實驗方案通過北京體育大學道德倫理審查專家委員會的審查（審批編號：2019020H）。受試者的采樣均為無創的唾液采集，在采樣前受試者閱讀并填寫知情同意書。

取口腔脫落細胞：取樣前用清水漱口，為了避免樣本不被污染，漱口后勿進食飲料和零食等，漱口后30 min由測試人員拿口腔拭子取樣，在口腔左右內壁涂抹10次，取樣時要注意力度稍大，取樣后置于4℃保存。

1.3 DNA的提取

取樣后按照口腔試劑盒中的提取步驟進行提取。

1.4 基因分型

采用SNaPshot技術對樣本進行SNP分型。通過反應，引物延伸一個堿基即終止，再經測序儀檢測，根據峰的移動位置確定該延伸產物對應的SNP位點，根據峰的顏色可得知插入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型（圖1）。

圖1 SNapshot原理Figure 1. SNapshot Principle

1.4.1 PCR引物設計合成

表1 各基因位點引物名稱與引物序列Table 1 Primer Name and Primer Sequence for Each Gene Locus

依據NCBI網站公布的基因序列，用Primer 5.0軟件設計PCR引物。

1.4.2 擴增反應、延伸反應及純化

擴增反應、延伸反應及純化等步驟參考3730XL儀器操作指南進行。

1.4.3 基因分型結果

每個位點對應的位置上如果出現單一的一個較長的波峰，說明這個基因位點的基因型為純合型，如果出現兩個連續較短的波峰，說明這個基因位點的基因型為雜合型（圖2）。

圖2 某一樣本SNP基因分型結果Figure 2. Results of SNPGenotyping of a Sample

1.5 數理統計

每組的基因分型結果均進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，當P＞0.05時，說明基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明研究對象具有群體代表性。每組的基因型與等位基因分布數據均采用卡方檢驗，將P＜0.05定義為兩組的基因型分布與等位基因分布差異具有統計學意義。

2 研究結果

2.1 各位點基因分型結果的Hardy-Weinberg平衡檢驗結果

54名優秀柔道運動員與180名普通大學生各基因位點經Hardy-Weinberg平衡檢驗符合Hardy-Weinberg平衡定律（表2），表明研究對象具有群體代表性（P＞0.05）。

表2 兩組各位點基因分型結果的Hardy-Weinberg平衡檢驗結果Table 2 Genotyping Results of Each Locus in Two Groups Test‐ed by Hardy-Weinberg Equilibrium Test

2.2 各位點基因型分布結果和等位基因分布結果

ACTN3基因rs1815739位點中J組CC基因型頻率顯著高于對照組（P＜0.05；表3），C等位基因頻率顯著高于對照組（P＜0.05）；CNTFR基因rs41274853位點中J組GG基因型頻率顯著高于對照組（P＜0.05），G等位基因頻率顯著高于對照組（P＜0.05）。其余基因位點中基因型頻率與等位基因頻率在J組和C組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 兩組間各位點基因型分布結果和等位基因分布結果的統計顯著性

ACTN3基因rs1815739位點基因型分布與等位基因分布在優秀柔道運動員和普通人之間的差異具有統計學意義（P＜0.01；表4）；CNTFR基因rs41274853位點基因型分布與等位基因分布在優秀柔道運動員和普通人之間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3 分析與討論

3.1 ACTN3基因rs1815739位點與爆發力的關系

本研究發現，優秀運動員（健將級及以上）的ACTN3基因rs1815739位點基因型分布、等位基因分布與C組相比差異具有統計學意義（P＜0.01；表4），J組中CC基因型頻率顯著高于C組，且CC基因型在優秀運動員中的分布頻率高于CT、TT基因型頻率（表3），表明該基因多態性位點與優秀柔道運動員存在關聯。

表3 兩組各位點基因型分布結果和等位基因分布結果Table 3 Results of Genotype Distribution andAllele Distribution of Each Locus in Two Groups

表4 兩組間（J vs.C）各位點基因型分布與等位基因分布結果的統計顯著性Table 4 Statistical Significance of Results of Genotype Distribution andAllele Distribution of Each Locus between Two Groups（J vs.C）

Rodriguez-Romo等（2013）研究該位點時未發現西班牙精英男性柔道運動員與普通人之間存在差異，得出ACTN3基因rs1815739多態性與優秀柔道運動員競技狀態不顯著相關。同樣是以優秀柔道運動員為研究對象，可能是因為基因多態性存在地域、人種的差異，從而引起結果不一致。

Kikuchi等（2012）對日本優秀摔跤運動員進行ACTN3基因多態性分析，發現ACTN3基因多態性與日本優秀摔跤運動員的運動狀態有關。該研究結果與本研究結果一致，可以看出即便兩個研究中的實驗對象民族不同，但兩個項目的特點類似，均是以高強度對抗的間歇運動，且以爆發力為主的項目。

楊曉琳等（2010）與李燕春等（2016）在研究該位點時發現CC基因型可作為中國北方漢族舉重運動員與中、長距離游泳運動員選材的分子標記。楊若愚（2017）在中國優秀運動員爆發力相關基因多態性及其預測模型的研究中發現，ACTN3基因rs1815739位點與我國優秀運動員的爆發力存在相關。由此可見，在以我國優秀運動員為研究對象時，上述研究與本研究結果保持一致，因此，在選擇研究對象時，要保證優秀組與普通組的民族、地區來源相一致。鑒于全國范圍內柔道項目健將數量較少，本研究在進行兩組比較時，保證民族相一致（均為漢族），從而減小誤差，提高實驗結果的準確性。

結合該位點發展趨勢來看，已被研究證明該位點與優秀運動員的爆發力存在關聯。有研究表明，ACTN3基因rs1815739位點表現的CC基因型與C等位基因在速度和力量素質中占優勢（楊若愚，2017；Ahmetov et al.，2015；Moran et al.，2007；Vincent et al.，2007；Yang et al.，2017）。上述結果的一致性表明，該位點對肌肉的收縮速度、爆發力有一定影響。研究表明，ACTN3基因指導合成的α-輔肌動蛋白-3僅存在于快肌纖維中，α-輔肌動蛋白-3在肌肉快速收縮過程中對其進行保護。動物實驗表明，含有α-輔肌動蛋白-3的小鼠模型中無氧代謝酶活性較高（Ma‐carthur et al.，2007；Vincent et al.，2007）。

柔道屬于高強度的對抗運動，代謝途徑以無氧代謝為主，爆發力直接影響比賽成績。本研究證明了基因型CC與等位基因C對于柔道項目是優勢基因型，因此，在進行運動員選材時可采用該方法輔助運動員選材，從而提高運動員的成才率，為后續基因選材提供理論依據以及數據支持。

3.2 CNTFR基因rs41274853位點與爆發力的關系

本研究發現，優秀運動員（健將級及以上）的CNTFR基因rs41274853位點基因型分布、等位基因分布與C組相比差異具有統計學意義（P＜0.05；表4），J組中GG基因型頻率顯著高于C組，且GG基因型在優秀運動員中的分布頻率高于GA、AA基因型頻率（表3），表明該基因多態性位點與優秀柔道運動員存在關聯。

Miyamoto等（2016）以日本精英運動員為研究對象時發現，該基因位點多態性與國際短跑力量運動員的力量表型指標顯著相關，研究結果與本研究結果保持一致。

本研究結果與楊若愚（2017）等的研究結果不一致。原因如下：1）選擇爆發力項目時存在一定偏差，分析中國優秀運動員爆發力相關基因多態性及其預測模型的研究發現，在選擇爆發力項目的優秀運動員時涵蓋多個項目（田徑、標槍、撐竿跳、跳高、跳遠等），多樣化的爆發力項目可能會造成研究結果的多樣性；2）研究對象的選擇不夠嚴謹，分析中國優秀運動員爆發力相關基因多態性及其預測模型的研究發現，對于爆發力組的人員選取并未控制研究對象的民族一致性，只是保證了人員所從事的項目均是以爆發力為主的項目，對照組也未保證民族一致；3）優秀組與普通組的人數比例存在一定偏差，分析中國優秀運動員爆發力相關基因多態性及其預測模型的研究發現，優秀組與普通組人數比例約為1∶1，國內外研究在進行SNP位點分析比對時發現，優秀組與普通組的人數比例約為1∶3。因此，本研究在保證爆發力項目獨立的基礎上，J組與C組的民族保持一致，J組與C組的人數比例大約控制在1∶3。未來，尚需研究進一步證實該位點與爆發力項目優秀運動員之間的關聯。

目前，鮮見國內關于該位點與運動能力的研究，以往的研究表明，CNTF作為一種神經營養因子可以營養神經和肌肉，與受體結合后發揮化學傳遞作用，從而為大多數神經細胞的生長和分化提供營養（Fraysse et al.，2000；Gayagay et al.，1998；Guillet et al.，1999）。柔道項目是一項高強度的對抗運動，肌肉的收縮是在神經的調控下完成的，提高神經系統的興奮性可以增加運動單位的募集效果，從而動員更多的肌纖維參與肌肉的收縮，提高機體的爆發力。從該基因影響的生理機制來看，未來可能是一個潛在的爆發力基因位點。因此，CNTFR基因可能是改變肌肉的收縮特性來影響肌肉的性能，同時，可能也與肌肉的體積相關，CNTFR基因與運動員狀態和肌肉表現關系的分子機制尚不清楚，需要進一步研究證明。值得注意的是，在保證研究對象人數比例合適的情況下，應增加該基因的多個位點進行分析，從而提高實驗結果的準確性。

3.3 其他基因位點與爆發力的關系

PPARα是調節脂質、葡萄糖能量平衡，血管炎癥的轉錄因子，以及調節骨骼肌和心肌脂肪酸的氧化，Petr等（2014）發現，C等位基因攜帶個體與捷克精英男性冰球運動員狀態相關。ACE是腎素-血管緊張素系統中的一個關鍵酶，可以引起心肌細胞肥大，造成運動性心肌肥大，從而影響機體的心血管功能。Papadimitriou等（2016）發現，AA型的短跑運動員能夠以更短的時間完成沖刺，認為該型的運動員具有較好的爆發力。VDR主要參與維持鈣磷平衡，通過影響基因轉錄調控相應蛋白的合成。

本研究尚未發現選取的PPARα基因rs4253778位點、ACE基因rs1799752位點、VDR基因rs7975232和rs2228570位點以及ADBR3基因rs4994位點與我國優秀柔道運動員爆發力相關，還需進一步的實驗考證。

4 結論

ACTN3基因rs1815739位點、CNTFR基因rs41274853位點可確定為與我國優秀柔道運動員爆發力存在關聯的基因位點，日后可作為基因選材的分子標記。