GSNOR的原核表達及亞硝基化修飾對其活性的影響

張林林, 韓 毅

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

S-亞硝基谷胱甘肽還原酶(GSNOR)的生物學研究起源于動物和大腸桿菌,從細菌到人類所有物種中都存在,且保守性高。其最初被認定為是一個依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶,后來發現其催化反應過程包含 S-亞硝基谷胱甘肽羥基的氧化、谷胱甘肽與甲醛成形成 S-甲?；入赘孰腫1]。因此,重新命名為 S-亞硝基谷胱甘肽還原酶,其在植物生長發育過程中扮演著重要的角色。研究已發現,在番茄中,抑制GSNOR的表達提高了內源的NO和S-亞硝基化水平,導致了發芽率提高、根和下胚軸生長被抑制、根毛數量減少,頂端優勢被破壞,側枝生長被促進、光合作用降低、果實結實率和產量低等不良影響[2];在擬南芥中發現GSNOR基因的突變出現了生長缺陷、植物疾病反應受損、熱敏感性等問題[3-4]。因此,研究植物體內的GSNOR活性調節機制是十分必要的。

NO作為一種信號分子來調節植物中的許多細胞功能和信號傳導,其在植物生長發育、代謝和脅迫響應等的調節功能已被廣泛研究。在動物中,NO也以信號分子的形式介導神經調節、細胞凋亡等途徑[5-6]。蛋白質的翻譯后修飾是NO依賴信號通路的重要特征[7],NO可以通過蛋白翻譯后修飾來影響酶或蛋白質的活性和功能。例如蛋白質的不可逆硝化和可逆亞硝基化等, NO也可以以離子形式結合到過渡金屬上,形成金屬-亞硝?；j合物,稱為金屬亞硝化作用。其中作為亞硝基基團(—NO)與半胱氨酸(Cys)硫醇的共價連接的蛋白質S-亞硝化是NO生物學活性的關鍵機制[8-10]。S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)是NO的主要儲存庫和轉運形式,比NO自由基穩定,可將其NO部分轉移到蛋白質上,其在植物體內的水平由其合成或降解2個途徑決定。NO及其衍生物活性氮在有氧條件下均能與細胞內的抗氧化分子谷胱甘肽反應形成亞硝基谷胱甘肽(GSNO)。非酶促途徑和酶促途徑是GSNO的2種降解途徑[11],非酶途徑為紫外線、高溫、堿等的破壞,而酶促途徑的關鍵酶為GSNOR,它不可逆降解GSNO,這一作用對于維持亞硝基化的穩態十分重要。

研究發現,擬南芥GSNOR包含9個高度保守的非鋅配位半胱氨酸殘基,可發生S-亞硝化、谷胱甘肽化或可逆氧化等翻譯后修飾,其中Cys10、Cys271、Cys370 共3個位點被認為在GSNOR活性的調節中具有保守作用[12]。本文運用原核表達的方法將GSNOR體外表達并分離出,探索NO能否亞硝基化GSNOR,以及能否通過這種修飾影響GSNOR的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

擬南芥(哥倫比亞)、PET28a(+)質粒、大腸桿菌DH5α克隆菌株、大腸桿菌BL21表達菌株。

1.1.2 實驗試劑

反轉錄酶、高保真DNA聚合酶、限制性內切酶、Taq酶、T4DNA連接酶、鎳柱、咪唑、質粒提取試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒、瓊脂粉、酵母提取物、牛肉膏。

1.2 儀器

高溫高壓滅菌鍋、恒溫培養箱、超凈工作臺、真空泵等恒溫培養震蕩器、紫外分光光度計、冷柜等。

1.3 方法

1.3.1 目的基因克隆

從tair網站中搜索目的基因的cDNA序列(GSONR的登錄號為AT5G43940),根據cDNA序列設計出引物GSNOR-F和GSNOR-R。

提取野生型擬南芥總RNA,將mRNA反轉得到cDNA,以cDNA為模板擴增GSNOR基因的全編碼序列(coding sequence,CDS)。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)的反應條件為98 ℃、3 min；98 ℃、10 s;54 ℃、15 s;72 ℃、80 s;72 ℃、10 min。PCR產物和PET28a(+)載體的連接產物轉化大腸桿菌,確定陽性菌落后,提取質粒并測序。測序結果符合已知基因序列,將質粒轉化大腸桿菌表達感受態BL21,確認陽性菌落,保存甘油菌備用。

1.3.2 蛋白的誘導

將轉化大腸桿菌 BL21的陽性菌接種在4個裝有250 mL LB+250 μL kana的培養液中,在220 r/min、37 ℃條件下搖至菌的OD600為0.6,在每個錐形瓶中加1 mol/L的IPTG 50 μL(終濃度為0.2 mmol/L),22 ℃條件下誘導16～24 h。SDS-PAGE電泳確認是否誘導成功。

1.3.3 蛋白的純化

收集菌體沉淀并用溶液Ⅰ(20 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl,pH值為7.6)重懸,細胞裂解30 min,離心收集上清并抽濾,通過鎳柱純化蛋白,所有上柱的液體都需抽濾。用溶液Ⅰ、30 mL溶液Ⅱ(20 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl 、50 mmol/L咪唑, pH值為7.6)洗脫雜蛋白,用溶液Ⅲ(20 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl 、300 mmol/L咪唑,pH值為7.6)洗脫目的蛋白。利用透析法將咪唑除去,將蛋白保存在-80 ℃備用。

1.3.4 蛋白質量濃度和酶活的檢測

以牛血清蛋白為標準蛋白制作標準曲線,將目的蛋白稀釋合適的倍數測A595,計算蛋白質量濃度。底物GSNO在利用NADH的條件下能被GSNOR降解,測定NADH在A340的吸光值可計算出GSNOR的酶活[13]。根據實際的蛋白質量濃度來決定GSNOR用量。測定buffer(20 mmol/L Tris、0.5 mmol/L EDTA,pH值為8.0)、GSNOR蛋白、20 mmol/L GSNO的總體積為l mL,底物GSNO終濃度為400 μmol/L,檢測2 min。

1.3.5 亞硝基化水平檢測

本文利用生物素轉換技術(biotin switch technique,BST)[14]來檢測GNSOR能否被NO亞硝基化。先通過MMTS封閉巰基(—SH),然后用抗壞血酸將SNO還原為—SH,再用生物素Biotin標記—SH。處理的樣品經SDS-PAGE電泳后,蛋白轉到聚偏二氟乙烯膜上與生物素親和抗體Biotin-HRP孵育。顯影后可觀察到GSNOR蛋白亞硝基化水平。

1.3.6 DEA/NO和DTT處理GSNOR蛋白

1 mmol/L的NO供體2-(N,N-二乙基氨基)-二氮烯-2-氧二乙銨鹽(DEA/NO)和GSNOR蛋白孵育30 min后,一組加20 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)孵育30 min,另一組加緩沖液放置30 min,分別測定未用DEA/NO處理、DEA/NO處理但未加DTT還原及DEA/NO處理后加DTT還原這3組處理后的GSNOR蛋白的酶活。

2 結果與分析

2.1 GSNOR的PCR擴增結果

本文以擬南芥野生型的cDNA為模板,以GSNOR-F和GSNOR-R為引物進行擴增,核酸瓊脂糖電泳檢測結果如圖1所示,由圖1可知，擴增產物有一條特異性帶,與擬南芥GSNOR基因的大小相符(GSNOR大小為1 176 bp)。

圖1 PCR擴增GSNOR基因片段瓊脂糖電泳圖

2.2 PET28a(+)-GSNOR原核表達載體的鑒定

提取陽性菌落質粒進行測序,測序結果顯示質粒中連接的目的基因與GSNOR基因片段完全相符,未發生任何突變,將送去測序的菌落進行擴搖,提取質粒并轉入表達菌株BL21,挑取單克隆進行菌落鑒定。以GSNOR-F和GSNOR-R為引物,確認GSNOR與載體是否成功連接。菌落PET28a(+)-GSNOR/BL21的PCR電泳圖如圖2所示,圖2中,條帶在1 000 bp稍多的位置,與實際大小1 176 bp相符,因此可以選取含目的基因的單克隆作為誘導菌種。

圖2 菌落PET28a(+)-GSNOR/BL21 PCR電泳圖

2.3 GSNOR蛋白的誘導結果

在22 ℃條件下,0.2 mmol/L IPTG誘導12～16 h,SDS-PAGE電泳檢測誘導產物如圖3所示,圖3中,M代表Marker;1泳道代表未誘導時大腸桿菌中的蛋白分布;2、3泳道代表誘導后的蛋白分布。由圖3可知,在接近42.7 kDa(GSNOR為42 kDa,6個組氨酸為0.9 kDa)處,誘導后的2、3泳道與對照1泳道相比明顯增多,表明GSNOR蛋白被成功誘導。

圖3 GSNOR蛋白誘導表達SDS-PAGE電泳圖

2.4 GSNOR蛋白的純化結果

誘導的粗蛋白利用鎳柱純化,在蛋白上樣后,帶有His標簽的融合蛋白特異性結合到柱子里,其他的雜蛋白隨之流出。鎳與咪唑發生競爭性結合,目的蛋白則被洗脫下來,即GSONR與雜蛋白成功分離,SDS-PAGE電泳檢測不同時段的洗脫液,電泳圖如圖4所示。

圖4中,M代表Marker;1、2、3泳道代表雜蛋白的洗脫結果;4、5、6泳道代表目的蛋白的洗脫結果,4泳道的洗脫液含大量的目的蛋白,利用透析袋將該洗脫液的咪唑脫去后,將目的蛋白置于-80 ℃保存。

圖4 GSNOR蛋白純化SDS-PAGE電泳圖

2.5 GSNOR蛋白的質量濃度及酶活檢測結果

以牛血清蛋白為標準蛋白制作標準曲線,據此標準曲線算出蛋白質量濃度為0.77 μg/μL。以GSNO為底物,NADH為還原力測得酶活約為140 U/mg。蛋白質量濃度、純度及活力足以支持下一步實驗。

2.6 亞硝基化水的檢測結果

為確定NO對GSNOR的修飾是否是亞硝基化修飾,本文利用BST技術檢測NO處理后的GSNOR的亞硝基化程度和DTT還原NO處理的GSNOR蛋白的亞硝基化程度，結果如圖5所示。由圖5可知,未用NO處理時GSNOR蛋白幾乎無亞硝基化,而NO處理后未用DTT還原的GSNOR蛋白發生了明顯的亞硝基化,加DTT還原后,亞硝基化程度明顯削弱。表明GSNOR在NO處理后經過了S-亞硝基化。

圖5 GSNOR的亞硝基化水平分析

2.7 GSNOR蛋白處理后的酶活檢測結果

DEA/NO和DTT處理 GSNOR后的酶活分析如圖6所示,由圖6可知,1 mmol/L NO供體DEA/NO處理GSNOR后會導致其酶活降低,且還原劑DTT會使GSNOR酶活恢復。說明NO使得GSNOR發生了亞硝基化修飾,且這種修飾導致了GSNOR活性下降,還原劑DTT可以還原這種修飾,使酶活恢復。

圖6 DEA/NO和DTT處理 GSNOR后的酶活分析

3 討論與展望

蛋白質是生命的物質基礎,是構成細胞的基本有機物,研究蛋白質的功能與結構是重中之重,獲得大量純化的蛋白質是研究的基礎。許多蛋白翻譯后修飾發現是通過體外表達目的蛋白，然后與猜測的物質直接反應從而確定兩者是否有關聯,所得到的結果可為體內的研究提供思路。目前有四大蛋白表達系統,分別為哺乳動物蛋白表達、原核表達系統、酵母表達系統和昆蟲表達系統。原核表達系統中的大腸桿菌表達系統是最常見的，這是由于大腸桿菌遺傳背景清楚、表達水平高、成本低、操作簡單。原核蛋白表達是將外源目的基因,通過構建表達載體并導入特定原核生物或細胞內表達(如大腸桿菌)。表達載體帶有特定標簽蛋白,例如His標簽蛋白,由6個寡聚的組氨酸組成,標簽是目的蛋白純化的關鍵。文中表達出的GSNOR蛋白酶活約為140 U/mg，質量濃度約為0.77 μg/μL。文獻[15]的GSNOR蛋白的酶活僅有100 U/mg[15],此方法可高效表達出GSNOR蛋白,說明原核表達載體及相關條件適合GSNOR蛋白的表達。蛋白被修飾后,常用質譜法鑒定修飾位點,樣品所需體積小,同時對蛋白含量也有較高的要求,高效表達出高質量濃度的蛋白可解決這一問題。

NO的主要作用是對目標蛋白的半胱氨酸殘基進行亞硝基化的修飾。大多數蛋白質都含有半胱氨酸,但這種氨基酸殘基與NO的親和力可能有很大的不同。在文中,BST結果顯示,DEA/NO處理后,GSNOR蛋白發生了亞硝基化修飾,DTT顯著削弱亞硝基化水平,且GSNOR酶活被NO供體DEA/NO可逆抑制。此外,GSNOR的酶活也可被GSNO抑制,實驗過程中發現還原劑DTT可降解GSNO,因此選用了DEA/NO作為NO供體。兩者皆可修飾GSNOR,使得GSNOR酶活下降,說明GSNOR的某些半胱氨酸殘基被NO修飾且影響了GSNOR的活性。GSNOR的這種修飾可能代表一種信號,對細胞內的GSNO水平起著調控作用。GSNOR可降解GSNO,而NO及其衍生物又能修飾GSNOR,由此推測,NO可能通過修飾GSNOR的半胱氨酸影響GSNOR的活性,進而影響了GSNO的水平。

4 結 論

本文建立了體外高效表達GSNOR的方法,獲得了質量濃度約0.77 μg/μL的GSNOR蛋白,并探索亞硝基化修飾對GSNOR酶活的影響,為NO的信號轉導機制及GSNOR的功能和結構的研究提供了思路和基礎。