四君子湯通過影響TNF-α、IL-6干預脾虛大鼠胃黏膜損傷的實驗研究*

周克平 宋文龍 肖林秀 吳芳芳

（1浙江省杭州市建德市中西醫結合醫院 建德 311600；2浙江省杭州市建德市第一人民醫院 建德 311600）

中醫學認為，脾居于人體中焦，為“中央之土”，主運化，為氣血生化之源，五臟六腑氣機升降出入賴之維持。人體生理機能的正常運轉，有賴于脾胃將攝入的營養物質化為精微，吸收轉輸至全身，維持人體內外平衡，抵御病邪。有研究[1~4]表明，脾虛狀態下，致傷因子造成胃黏膜損傷，當損傷超過機體原有防御及修復功能時，胃黏膜屏障作用發生紊亂，出現病理性損傷。

四君子湯是益氣健脾的代表方劑，來源于宋代《太平惠民和劑局方》，由黨參、白術、茯苓和甘草組成，臨床用于治療脾氣虛證引起的食欲不振、脘腹虛脹等不良癥狀[5~7]。本研究通過復制大鼠脾虛模型，觀察四君子湯對脾虛大鼠胃黏膜損傷和炎癥介質表達的影響，并與臨床常用胃黏膜保護劑（枸櫞酸鉍鉀）進行比較，分析脾虛與胃黏膜屏障功能改變之間的相關性，以期從胃黏膜損傷變化的角度出發，探討四君子湯治療脾虛大鼠的作用機制。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠，10周齡，體質量330~360 g，共50只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2017-0005；合格證號：20170005023335]。試驗前飼養在動物房環境中適應1周后開始進行造模及后續試驗。

1.2 藥物及試劑 小承氣湯由厚樸、枳實、大黃（比例3:3:2）組成；四君子湯由黨參、白術、茯苓、甘草（比例2:2:2:1）組成，均由醫院藥劑科提供，并由制劑室煎取后[8]，70℃的條件下旋轉蒸發，濃縮至220 ml，即得到濃縮液每毫升含生藥量1.0 g。滅菌注射用水（國藥準字H41024240）、枸櫞酸鉍鉀片（國藥準字H10920098，使用滅菌注射用水配置成濃度為1 800 mg/L含藥溶液）、生理鹽水（國藥準字H20013310，使用滅菌注射用水配置成濃度為1 800 mg/L含藥溶液）；Rat IL-6 ELISA試劑盒，聯科生物，貨號EK306/3-48；Rat TNF-αELISA試劑盒，聯科生物，貨號EK382/3-48。

1.3 儀器 全波長酶標儀，SpectraMax Plus 384型，美國MD；離心機，L3-800R低速冷凍離心機，采購自湖南湘儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠分組及模型建立50只大鼠常規飼喂l周后隨機分為空白對照組、脾虛模型組、自然康復組、四君子湯組和西藥組（枸櫞酸鉍鉀），各10只。除空白對照組外，其余4組均制作大鼠長期脾虛模型。脾虛模型組大鼠小承氣湯3 ml/（次·只）灌胃，隔日1次，同時隔日喂食，共24周[9~10]。

1.4.2 給藥 空白組大鼠常規飼喂，并采用生理鹽水3 ml/次，隔日1次進行灌胃，持續24周；脾虛模型組大鼠每2天喂食1次，模擬饑飽失節，聯合小承氣湯3 ml/次灌胃，隔日1次，共24周；自然康復組大鼠前20周飼喂與脾虛模型組一致，20周后予常規飼養，共24周；四君子湯組飼喂前20周同脾虛模型組，20周后改常規飼喂，并予四君子湯（4 ml/次）連續灌胃4周，1次/d；西藥組飼喂前20周同脾虛模型組，20周后改常規飼喂，按13.5 mg/kg（3 ml）給予枸櫞酸鉍鉀灌胃，連續灌胃4周，1次/d。均于實驗24周末處死大鼠進行取材處理。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 脾虛大鼠成模評價 通過對各組大鼠造模前后的行為變化、體質量、毛色、精神狀態、大便性質進行對比和分析。

1.5.2 ELISA檢測 （1）腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平檢測：使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫。制備標準品，依次倍比稀釋成300.00 pg/ml、150.00 pg/ml、75.00 pg/ml、37.50 pg/ml、18.75 pg/ml、9.38 pg/ml、4.69 pg/ml，標準品稀釋液（0 pg/ml）直接作為空白孔。加樣，預設7個標準孔，按濃度梯度分別加入100μl標準品。空白孔則僅加入100μl試劑稀釋液，其余各孔則分別加入樣品10μl及檢測緩沖液90μl。檢測抗體，每孔加入50μl經稀釋抗體。封板后以300 r/min下震蕩，室溫孵育2 h。棄孔內液體，以350μl的洗滌液重復洗6次后吸水紙上拍干。每孔加入100μl稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素后封板，300 r/min下震蕩孵育45 min。棄孔內液體，以350μl的洗滌液重復洗6次后吸水紙上拍干。上述步驟完成后每孔加TMB底物溶液100μl，避光顯色5~30 min，最后在每孔加終止溶液100μl，終止反應。在酶標板底無水滴、無氣泡后，用酶標儀在450 nm波長和630 nm波長測量各孔的光密度值（OD值）。（2）白細胞介素-6（IL-6）水平檢測：使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫。制備標準品，依次倍比稀釋成2 000.00 pg/ml、1 000.00 pg/ml、500.00 pg/ml、250.00 pg/ml、125.00 pg/ml、62.50 pg/ml、31.25 pg/ml，標準品稀釋液（0 pg/ml）直接作為空白孔。其余步驟同TNF-α檢測。

1.5.3 采用Guth法評價大鼠胃黏膜的潰瘍指數摘下全胃，10 min后沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗，再平展于濾紙上，全胃各病灶長度之和為損傷指數，以mm表示。損傷≤1 mm（包括糜爛點）為1分；1 mm＜損傷≤2 mm為2分；2 mm＜損傷≤3 mm為3分；3 mm＜損傷≤4 mm為4分；＞4 mm為5分；損傷寬度＞2 mm者胃黏膜潰瘍指數（UI）加倍。

1.5.4 病理改變觀察 取大鼠胃經石蠟包埋后組織切片，常規HE染色，鏡下觀察病理改變情況。

1.6 統計學方法 所得數據采用SPSS22.0軟件進行分析。各樣本均數間以單因素方差分析，多個樣本均數間兩兩比較，采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 五組一般情況及體質量比較 （1）一般情況：空白對照組毛色、精神狀態及活動情況均良好；造模后（20周）造模四組均出現毛較凌亂，精神狀態及活動情況較萎靡，大便時有稀溏等情況；24周后，脾虛模型組毛較凌亂、精神狀態及活動情況較萎靡，自然康復組毛一般、精神狀態及活動情況尚可，西藥組及四君子湯組毛一般、精神狀態及活動情況尚可，大便性質尚正常。（2）體質量變化：造模前，各組大鼠間體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），有可比性。造模后，各組大鼠體質量較前均有所升高，其中空白對照組[（421.60±56.89）g]及自然康復組[（402.00±25.80）g]較前升高較明顯，但各組間差異無統計學意義（P＞0.05），與造模前比較，差異也無統計學意義（P＞0.05）。24周后，空白對照組[（523.40±61.65）g]、四君子湯組[（508.20±27.33）g]及西藥組[（486.40±45.32）g]與脾虛模型組[（418.6±44.62）g]比較，體質量有明顯上升，且差異有統計學意義（P＜0.05）；而自然康復組體質量（459.40±17.63）g雖較脾虛模型組有所升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。四君子湯組與西藥組大鼠24周時體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 五組大鼠體質量比較（g，±s）

表1 五組大鼠體質量比較（g，±s）

注：與空白對照組相比，#P＜0.05；與脾虛模型組相比，*P＜0.05；與自然康復組相比，△P＜0.05。

組別 n 造模前 造模后（20周） 治療后（24周）空白對照組脾虛模型組自然康復組四君子湯組西藥組10 10 10 10 10 392.80±35.75 383.00±20.45 385.40±29.45 384.60±24.13 386.00±17.44 421.60±56.89 394.40±25.01 402.00±25.80 393.60±11.06 409.00±20.63 523.40±61.65 418.60±44.62#459.40±17.63 508.20±27.33*△486.40±45.32*

2.2 五組TNF-α、IL-6水平比較 與空白對照組比較，脾虛模型組TNF-α、IL-6在血清中表達上調，且有極顯著性差異（P＜0.01）；與脾虛模型組相比，自然康復組TNF-α、IL-6含量無明顯變化（P＞0.05），提示應激狀態下，大鼠胃黏膜內攻擊因素明顯增強，胃黏膜損傷嚴重，可能是造成胃黏膜損傷的主要因素。與脾虛模型組相比，四君子湯組及西藥組大鼠TNF-α、IL-6表達水平明顯下調，且有極顯著性差異（P＜0.01）。而相較于西藥組，四君子湯組大鼠TNF-α、IL-6表達水平與之相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。結合胃黏膜損傷情況，說明四君子湯對胃黏膜有與枸櫞酸鉍鉀相當的保護和促修復作用。見表2。

表2 五組大鼠TNF-α、IL-6水平比較（pg/ml，±s）

表2 五組大鼠TNF-α、IL-6水平比較（pg/ml，±s）

注：與空白對照組相比，#P＜0.05；與脾虛模型組相比，*P＜0.01；與自然康復組相比，△P＜0.01。

組別 n空白對照組脾虛模型組自然康復組四君子湯組西藥組10 10 10 10 10 IL-6 TNF-α 61.40±23.90 766.35±166.62#711.39±140.51#407.18±25.94#*△381.82±33.76#*△164.70±29.50 567.11±29.77#532.00±18.69 227.43±27.09#*△214.44±18.31#*△

2.3 胃黏膜損傷指數觀察 空白對照組大鼠胃黏膜組織表面色澤紅潤，黏膜較為完整，無明顯潰瘍等損傷，腺體排列整齊、均勻、致密。見圖1。脾虛模型組大鼠黏膜下充血明顯，且黏膜表面呈現多條條索狀出血面。見圖2。自然康復組大鼠胃黏膜可見點狀及條索狀潰瘍損傷，程度較模型組減輕；而四君子湯組及西藥組大鼠胃黏膜主要表現為充血而條索狀潰瘍損傷不明顯。見圖3~圖5。與模型組（19.20±7.40）mm相比，四君子湯組（5.20±1.92）mm及西藥組（5.00±1.58）mm損傷程度較輕，都存在極顯著性差異（P＜0.01），且要優于自然康復組（9.40±3.58）mm，P＜0.05，但兩藥物治療組間比較，差異無顯著性。表明四君子湯能在一定程度上緩解脾虛大鼠胃黏膜的損傷性潰瘍，療效與枸櫞酸鉍鉀相近。見表3。

圖1 空白對照組

圖2 脾虛模型組

圖3 自然康復組

圖4 四君子湯組

圖5 西藥組

表3 胃黏膜損傷指數（n＝10，mm，±s）

表3 胃黏膜損傷指數（n＝10，mm，±s）

注：與空白對照組比較，▲P＜0.01；與脾虛模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與自然康復組比較，△P＜0.05。

組別 空白對照組 脾虛模型組 自然康復組 四君子湯組 西藥組Mean SD Mean±SD 0.00 0.00 0.00±0.00 19.20 7.40 19.20±7.40▲9.40 3.58 9.40±3.58▲*5.20 1.92 5.20±1.92▲#△5.00 1.58 5.00±1.58▲#△

2.4 胃組織病理改變HE染色后鏡下觀察，空白對照組大鼠胃黏膜結構、層次較清楚。見圖6。脾虛模型組大鼠胃黏膜變薄，黏膜上皮細胞壞死，呈片狀脫落，連續性中斷，水腫明顯。見圖7。自然康復組大鼠胃黏膜部分中斷，黏膜、黏膜下層部分水腫，部分可見炎細胞浸潤。見圖8。四君子湯組大鼠胃黏膜、黏膜下層充血水腫輕，腺體排列整齊，有少量炎細胞浸潤。見圖9。西藥組胃黏膜及黏膜下層稍水腫，腺體排列尚整齊，部分可見炎細胞浸潤。見圖10。

圖6 空白對照組

圖7 脾虛模型組

圖8 自然康復組

圖9 四君子湯組

圖10 西藥組

3 討論

中醫學理論認為，脾胃為“后天之本、氣血生化之源”。脾主運化，胃主受納，脾氣健運，則化源充足，氣血津液得以灌溉四旁，陰平陽秘，機體才能生機盎然，四臟亦可安和，即如《金匱要略》所言“四季脾旺不受邪”[11~12]。倘使脾氣虛弱，失其健運，不能正常運化水谷，輸布精微，則體內氣血生化無以為繼，臟腑形體長期失養，正氣虧虛于內，使人體防御能力不斷下降，而容易產生各種病證，特別是容易導致胃內黏膜的損害[5~7]。臨床上，大部分慢性疾病后期都會出現倦怠乏力、少氣懶言、腹脹納呆、面色萎黃、大便溏薄、消瘦、舌淡苔白、脈緩弱等脾虛證主要證候。本實驗模擬人體常見導致脾虛誘因，以小承氣湯灌胃聯合飲食失節法建模，造模結束后觀察到脾虛模型組大鼠出現皮毛較凌亂、精神狀態及活動萎靡，大便時有稀溏等脾虛表現。對大鼠胃黏膜組織進行進一步觀察，可見不同程度點狀或條索狀潰瘍損傷，HE染色下，胃黏膜變薄，黏膜上皮細胞壞死，呈片狀脫落，連續性中斷，水腫明顯，提示大鼠造模成功。

正常情況下，胃黏膜對損傷有一定自我修復能力。作為常見細胞因子，TNF-α主要由脂肪組織中單核-吞噬細胞及其他多種細胞產生，不但能夠有選擇性地殺傷某些腫瘤細胞，對正常細胞無明顯毒性，還能在一定程度上發揮對免疫、感染與炎癥反應調節作用[13]。近年研究[14~18]表明，TNF-α作為胃黏膜炎癥發生發展階段的重要內源性細胞因子之一，在胃黏膜炎癥反應中起到重要作用：（1）提升機體內中性粒細胞的活化、趨化及黏附水平，耗氧量顯著增加，產生大量氧自由基，上調局部炎癥反應水平；（2）可提高白細胞在血管內皮細胞上黏附性，使內皮細胞受到損傷而啟動血管內凝血系統，引起機體局部血液循環障礙，影響到黏膜血氧供給加劇潰瘍。此外，高水平的IL-6可以長時間作用于胃黏膜，消耗大量的上皮細胞，引起胃酸分泌減少，削弱了對胃內化學物質的防御能力，有利于有害物質對胃黏膜的侵蝕、損害，也是參與潰瘍形成的一個關鍵性細胞免疫因素[17~21]。曹琰、徐小穎等[22~23]發現，與正常大鼠相比，脾虛大鼠血清中TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6等細胞因子表達顯著上調，而健脾類中藥能通過改善脾虛大鼠的消化道系統，調節上述細胞因子的分泌，提升機體的免疫功能，發揮健脾益氣功效。在本實驗中，與空白對照組大鼠相比，脾虛模型組大鼠TNF-α、IL-6水平也表現出上升趨勢，與上述研究結果相似，結合脾虛模型組大鼠胃黏膜表現，表明IL-6、TNF-α升高可使大鼠胃黏膜出現實質性損傷。

作為臨床常用補氣健脾經典方藥，四君子湯源出《太平惠民和劑局方》，常用于“榮衛氣虛，臟腑怯弱。心腹脹滿，全不思食，腸鳴泄瀉，穢吐逆……”。人參、白術、茯苓和甘草為其組成藥物。本研究通過直接觀察，測量并計算大鼠胃黏膜潰瘍損傷指數，同時對大鼠胃黏膜病理變化進行對比，發現脾虛大鼠胃黏膜組織可見不同程度點狀或條索狀潰瘍損傷，HE染色下，胃黏膜變薄，黏膜上皮細胞壞死，呈片狀脫落，連續性中斷，水腫明顯。經四君子湯干預后，大鼠胃黏膜及黏膜下層出血、充血、糜爛均輕于脾虛模型組，腺體排列整齊，炎細胞浸潤情況減輕，與西藥組接近；血清檢測結果顯示，脾虛證能明顯上調TNF-α、IL-6的表達水平，從而降低脾虛大鼠胃黏膜局部損傷修復功能，經四君子湯原方治療后脾虛大鼠的TNF-α、IL-6明顯下降，胃黏膜損傷指數改善，說明四君子湯能通過下調TNF-α、IL-6表達，促進脾虛大鼠黏膜屏障的修復。

綜上所述，研究結果部分驗證了四君子湯對于防治脾虛患者胃黏膜損傷有重要意義，為臨床推廣應用該方治療胃病、預防胃黏膜損傷提供了實驗依據。但中藥復方對胃黏膜的保護作用是多方面的，還有待于進一步的研究。