隔藥灸關(guān)元穴對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)大鼠疼痛反應(yīng)與血清β-EP、子宮PGE2/PGF2α、脾臟NK細(xì)胞活性的影響*

秦中銀 陳盼碧 楊雯雯 金靈敏 唐徐韻 周楊嘉琪 侯天仙

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550002）

原發(fā)性痛經(jīng)（PD）是在女性無(wú)盆腔病理情況下出現(xiàn)月經(jīng)疼痛［1］，其中疼痛是降低PD患者生活質(zhì)量的主要原因之一［2］。在西醫(yī)方面，對(duì)于PD的治療尚無(wú)良好的方案，非甾體消炎藥是治療PD的一線藥物，但有諸多副作用，臨床應(yīng)用范圍有限［3］。中醫(yī)藥治療PD起效快，不良反應(yīng)小，尤其是艾灸治療PD療效確切［4］，在改善癥狀與遠(yuǎn)期治療效果方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。而隔藥灸是中醫(yī)外治法的重要構(gòu)成部分，對(duì)治療PD有較好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。關(guān)元穴作為治療PD的主穴，在治療PD的選穴頻次中排第2位［5-6］，在位置上關(guān)元穴與病位胞宮鄰近，與支配子宮平滑肌的T12～L1節(jié)段交感神經(jīng)有重疊［7］。臨床研究證實(shí)［8-9］，隔藥灸關(guān)元穴與直接灸關(guān)元穴治療PD均具有較好療效，但其機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)觀察隔藥灸關(guān)元穴對(duì)大鼠扭體反應(yīng)、血清β-內(nèi)啡肽（β-EP）、子宮組織前列腺素E2（PGE2）/前列腺素F2α（PGF2α）、脾臟NK細(xì)胞活性的變化，分析隔藥灸關(guān)元穴治療PD的可能機(jī)制以及與直接灸關(guān)元穴的效應(yīng)差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性Wistar大鼠32只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0011。動(dòng)物安置在通風(fēng)、自然光照環(huán)境，自由飲水和給食。本實(shí)驗(yàn)遵照國(guó)家有關(guān)動(dòng)物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 試藥與儀器 苯甲酸雌二醇由寧波第二激素廠提供［批號(hào)：（2011）lIi 0252511］；縮宮素由馬鞍山豐原制藥有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：34020473）；艾絨與少腹逐瘀湯方藥（當(dāng)歸∶川芎∶赤芍∶肉桂∶小茴香∶五靈脂∶沒(méi)藥∶生蒲黃∶延胡索∶炮姜=3∶1∶2∶1∶0.5∶2∶1∶3∶1∶1）由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房自制；K 562細(xì)胞株與大鼠脾臟NK細(xì)胞分離液試劑盒、大鼠β-EP、PGE2、PGF2α酶聯(lián)免疫試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物公司（批號(hào)分別是：K2011，RATP，DRE2050，DRE20017，DRE2125）；電子天平（美國(guó)奧豪斯）；低溫冰箱（青島Haier）；離心機(jī)（法國(guó)JUOAN）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD）。

1.3 分組與造模 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、隔藥灸關(guān)元組、直接灸關(guān)元組，每組8只。除空白對(duì)照組外，其余各組參考文獻(xiàn)建立痛經(jīng)模型［10］：持續(xù)10 d股部皮下注射苯甲酸雌二醇（第1日和第10日0.5 mg/d，第2～9天0.2 mg/d），末次注射苯甲酸雌二醇24 h后，腹腔注射2 U縮宮素制敏。空白對(duì)照同期股部皮下注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 治療方法 艾炷統(tǒng)一由艾絨制備，每壯0.5 g；藥餅用少腹逐瘀湯方藥按常規(guī)成人劑量，研磨成粉末，治療時(shí)用蒸餾水+透皮劑（氮酮）手工制成寬0.8 cm、高0.2 cm的藥餅。治療前2 d剪去大鼠“關(guān)元”穴及附近被毛，蘸涂脫毛劑，紗布拭去脫下的毛發(fā)。第11日起，將大鼠仰臥位固定在特制固定籠中，在大鼠清醒狀態(tài)下進(jìn)行治療。空白對(duì)照組與痛經(jīng)模型組正常飼養(yǎng)，均不做治療。隔藥灸關(guān)元組與直接灸關(guān)元組參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》取“關(guān)元”穴，常規(guī)消毒，隔藥灸關(guān)元組將藥餅放置“關(guān)元”穴上，再將艾炷放置藥餅上；直接灸關(guān)元組將艾炷放置“關(guān)元”穴上，點(diǎn)燃，兩組均艾灸7壯，每日1次，連續(xù)10 d。

1.5 扭體實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)第21天，治療結(jié)束30 min內(nèi)，每只動(dòng)物均腹腔注射縮宮素2 U，立即記錄30 min內(nèi)扭體次數(shù)。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 扭體實(shí)驗(yàn)完畢后，用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射，待大鼠完全昏迷后進(jìn)行樣本采集。1）血清β-EP檢測(cè)：將麻醉大鼠仰臥位固定于模型板，剝離股動(dòng)脈，取5 mL血液離心收集上清液，置于-70℃冰箱凍存，用于檢測(cè)β-EP含量。2）子宮組織PGE2、PGF2α含量檢測(cè)：取血完畢后，大鼠斷頸處死，迅速剖離其新鮮子宮組織，沖洗并拭干水分后精密取50 mg組織，加入提前預(yù)冷的PBS 0.5 mL，冰盒中充分研磨30 min，然后以4℃2 500 r/min離心10 min取上清液，-70℃保存，用于檢測(cè)PGE2、PGF2α含量。3）MTT比色法檢測(cè)各組動(dòng)物脾臟NK細(xì)胞活性：無(wú)菌操作下取新鮮脾臟組織，預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液沖洗血液，濾紙拭干后精密取50 mg組織，研磨、離心與保存方法同子宮組織。用含10%牛血清的1640培養(yǎng)液將脾細(xì)胞懸液稀釋，調(diào)至1×106/mL，靶細(xì)胞用k562（提前孵育24～48 h），調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/mL。96孔培養(yǎng)板用移液槍吸取效、靶細(xì)胞各100 μL，孵育30 min；效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔然后各滴加100 μL效應(yīng)細(xì)胞、1640培養(yǎng)液，靶細(xì)胞對(duì)照孔各滴加100 μL靶細(xì)胞、1640培養(yǎng)液，每個(gè)標(biāo)本3個(gè)復(fù)孔。各孔加入10 μL MTT在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱條件下共同孵育4 h；孵育完成后，吸棄上清液，各孔加 DMSO 150 μL，甘氨酸緩沖液（pH 10.5）20 μL，中等速度搖床10 min。以570 nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀計(jì)算各孔吸光度值，NK細(xì)胞活性計(jì)算用每個(gè)標(biāo)本3個(gè)復(fù)孔測(cè)定的均值計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，單因素方差分析比較各組差異，進(jìn)一步用LSD檢驗(yàn)兩組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況與扭體次數(shù)比較 見表1。造模前，各組大鼠飲食、行動(dòng)、精神與毛發(fā)色澤一切正常。造模后，除空白對(duì)照組無(wú)變化，模型組、隔藥灸關(guān)元組與直接灸關(guān)元組均出現(xiàn)改變，以模型組變化最為明顯，食欲減退，毛發(fā)暗淡，動(dòng)作遲緩。如表1所示，出現(xiàn)注射縮宮素后，空白對(duì)照組無(wú)扭體，模型組扭體次數(shù)較空白對(duì)照組明顯增多（P<0.01），與模型組比較，兩個(gè)治療組扭體次數(shù)顯著減少（P<0.01），但兩個(gè)治療組之間扭體次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠扭體次數(shù)及血清β-EP含量比較（±s）

表1 各組大鼠扭體次數(shù)及血清β-EP含量比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。下同。

組別空白對(duì)照組模型組隔藥灸關(guān)元組直接灸關(guān)元組n 8 8 8 8扭體次數(shù)（次/30 min）0 14.00±6.92*1.70±0.67#2.20±0.49#血清β-EP（pg/mL）205.54±26.28 103.97±28.51*178.27±22.44#139.15±22.90#

2.2 各組大鼠血清β-EP含量比較 見表1。與空白對(duì)照組比較，模型組血清β-EP顯著降低（P<0.01），與模型組比較，兩個(gè)治療組血清β-EP含量均明顯增加（P<0.01），但兩個(gè)治療組之間β-EP含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 各組大鼠子宮組織PGE2、PGF2α含量比較 見表2。與空白對(duì)照組比較，模型組子宮組織PGE2顯著降低（P<0.01），PGF2α明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，兩個(gè)治療組PGE2顯著提高（P<0.01），PGF2α明顯下降（P<0.01），但兩個(gè)治療組之間PGE2與PGF2α含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠子宮PGE2與PGF2α含量比較（pg/mg，±s）

表2 各組大鼠子宮PGE2與PGF2α含量比較（pg/mg，±s）

組別n PGE2PGF2α 8888空白對(duì)照組模型組隔藥灸關(guān)元組直接灸關(guān)元組22.09±7.92 8.25±2.58*17.80±2.97#16.60±3.24#55.45±16.12 80.41±22.28*50.40±11.59#47.54±10.54#

2.4 各組大鼠脾臟NK細(xì)胞活性比較 見表3。如表3所示，與空白對(duì)照組比較，模型組脾臟NK細(xì)胞活性顯著下降（P<0.01）；與模型組比較，兩個(gè)治療組脾臟NK細(xì)胞活性明顯提升（P<0.01）；與直接灸關(guān)元組比較，隔藥灸關(guān)元組NK細(xì)胞活性更高（P<0.05）。

表3 各組大鼠NK細(xì)胞活性比較（%，±s）

表3 各組大鼠NK細(xì)胞活性比較（%，±s）

注：與直接灸關(guān)元組比較，△P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型組隔藥灸關(guān)元組直接灸關(guān)元組n 888 8 NK細(xì)胞活性31.35±12.85 11.15±6.43*48.96±9.94#△34.63±6.88#

3 討 論

痛經(jīng)的主要病理變化是由于子宮平滑肌痙攣性收縮誘導(dǎo)子宮組織缺血缺氧導(dǎo)致疼痛［11］。在痛經(jīng)動(dòng)物模型研究中，扭體反應(yīng)是一個(gè)重要指標(biāo)，用于檢測(cè)鎮(zhèn)痛效應(yīng)［12］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隔藥灸關(guān)元與直接灸關(guān)元均可明顯減少PD大鼠扭體次數(shù)，提示隔藥灸關(guān)元與直接灸關(guān)元均可緩解PD大鼠疼痛，有較好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

PG是機(jī)體重要的內(nèi)分泌激素，PGE2和PGF2α是非妊娠子宮內(nèi)膜合成與釋放的主要激素，PGF2α可激活子宮內(nèi)小動(dòng)脈的PGF2α受體，刺激自主神經(jīng)纖維，促使平滑肌收縮引起疼痛［13］，而PGE2抑制平滑肌自發(fā)痙攣緩解疼痛。本研究結(jié)果表明，痛經(jīng)模型組較空白對(duì)照組子宮組織PGE2含量顯著減少，PGF2α含量顯著增加。經(jīng)治療后，隔藥灸關(guān)元組與直接灸關(guān)元組的子宮組織PGE2水平明顯升高、PGF2α水平明顯降低，提示隔藥灸關(guān)元與直接灸關(guān)元均可調(diào)控PD大鼠子宮組織中PGE2與PGF2α的合成與釋放，促成子宮舒張與抑制痙攣達(dá)到止痛效果。

β-EP作為內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用的神經(jīng)多肽，可直接靶向子宮，調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，其含量與痛經(jīng)的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系［14］，臨床研究發(fā)現(xiàn)痛經(jīng)血清中β-EP含量與患者疼痛程度呈負(fù)相關(guān)［15］。本研究表明，模型組血清β-EP含量顯著降低，誘發(fā)PD大鼠疼痛產(chǎn)生扭體反應(yīng)，而隔藥灸關(guān)元組與直接灸關(guān)元組的血清β-EP含量明顯升高，揭示隔藥灸關(guān)元與直接灸關(guān)元均可提高血清β-EP含量達(dá)到止痛作用。而β-EP作為內(nèi)源性阿片肽還可作用于NK細(xì)胞膜上的阿片受體而加強(qiáng)其殺傷活性來(lái)減輕疼痛［16］。NK不僅是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，同時(shí)也是子宮內(nèi)膜組織主要淋巴細(xì)胞，研究顯示，抑制NK細(xì)胞活性可降低疼痛閾值［17］。本研究結(jié)果顯示，隔藥灸關(guān)元與直接灸關(guān)元均可提高PD大鼠NK細(xì)胞活性，但隔藥灸關(guān)元與直接灸關(guān)元比較，前者對(duì)NK細(xì)胞活性的影響更明顯。

本實(shí)驗(yàn)中隔藥灸是間接灸的一種類型，是結(jié)合灸法和藥物作用的一種中醫(yī)外治法，與同屬中醫(yī)外治法的直接灸常用于PD的治療，具有較好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)［8-9］，本研究結(jié)果與之相符。但在本研究中，隔藥灸“關(guān)元”穴后，NK細(xì)胞的活性明顯高于直接灸“關(guān)元”，但在神經(jīng)、內(nèi)分泌相關(guān)因子中兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明隔藥灸關(guān)元對(duì)機(jī)體免疫功能的影響要優(yōu)于直接灸關(guān)元。原因可能有以下方面。1）隔藥灸關(guān)元組有藥餅的使用，藥餅的藥方為少腹逐瘀湯，該方做成隔藥灸的藥餅，結(jié)合了灸法與藥物的作用。另外在艾炷的溫?zé)岽碳ぷ饔孟拢幬锝?jīng)皮質(zhì)層吸收增加，在相關(guān)經(jīng)穴位置酶活性升高而促進(jìn)藥物的吸收［18］，增強(qiáng)了補(bǔ)益氣血、調(diào)經(jīng)止痛的作用。相關(guān)研究也表明少腹逐瘀湯具有調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫的功能［19-20］。2）艾炷燃燒同時(shí)產(chǎn)生溫?zé)嵝?yīng)、光學(xué)輻射和艾煙產(chǎn)物，不同隔物介質(zhì)對(duì)灸溫存在差異性影響從而獲得不同的灸效［21］。灸效也受多種因素的調(diào)控與影響，比如不同灸法、灸量等，本實(shí)驗(yàn)中隔藥灸與直接灸屬艾灸中的不同灸法，對(duì)灸效會(huì)產(chǎn)生不同的時(shí)效性。相關(guān)研究也揭示［22-23］，隔物灸不僅在經(jīng)穴局部位置發(fā)揮作用，隔物介質(zhì)還可滲透到皮下、肌層，起到改善局部微循環(huán)、提高免疫功能的作用。以上可能是隔藥灸對(duì)PD大鼠NK細(xì)胞活性影響優(yōu)于直接灸的原因。

綜上，隔藥灸關(guān)元可通過(guò)提高血清β-EP、子宮組織PGE2含量與脾臟NK細(xì)胞活性，降低子宮組織PGF2α含量起到較好鎮(zhèn)痛作用，其中隔藥灸與直接灸鎮(zhèn)痛效應(yīng)相當(dāng)。本研究中隔藥灸對(duì)NK細(xì)胞活性優(yōu)于直接灸的結(jié)果，隔藥灸對(duì)PD機(jī)體免疫功能的影響是否與隔物灸的介質(zhì)參與、不同灸法、灸量與灸溫等有關(guān)，將是我們下一步研究的重點(diǎn)。