MANF對A2型反應性星形膠質細胞增殖、凋亡的影響

劉 銳,丁振飛,戴 策,鐘 林,汪蕭和,尹宗生,高維陸

星形膠質細胞在神經系統中所占的比例最大，在神經膠質細胞中分布最為廣泛，也是膠質細胞中體積最大的一種。中樞神經系統中的星形膠質細胞能夠對不同性質的刺激做出不同的反應，活化為具有消極作用的A1型反應性星形膠質細胞(reactive astrocytes,RAS)和有積極作用的A2型RAS。有研究表明，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)可以使星形膠質細胞向A2型RAS轉化。中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)是近年來新發現的一種分泌型蛋白，存在于內質網和高爾基體中。MANF能夠在多種細胞中發揮生物學功能。但其在脊髓損傷中對RAS的影響卻未見相關文獻報道。該研究擬通過在體外進行大鼠脊髓星形膠質細胞的培養，并制備A2型RAS，采用不同濃度的MANF處理，并檢測其對A2型RAS增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清、DMEM/F12培養基(美國Gibco公司)；重組MANF蛋白、小鼠抗S100A10單克隆抗體(美國R&D Systems公司)；CCK-8試劑(上海陶素生化科技有限公司)；鏈霉素-青霉素、EdU試劑盒、TUNEL試劑盒(上海Beyotime生物技術公司)；兔抗GFAP單克隆抗體(美國Abcam公司)。倒置熒光顯微鏡(德國蔡司公司)，酶標儀(美國PE公司)。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠50只，3～4周齡，雌雄不拘，由安徽省實驗動物中心提供。

1.3 方法

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星形膠質細胞的制備 SD大鼠脫頸處死后，在無菌條件下取出脊髓組織，迅速轉入含有用冰預冷的PBS液的培養皿中，用眼科剪將組織塊剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，反復吹打后經200目細胞篩過濾，濾液收集于15 ml離心管中，轉入離心機離心5 min，轉速為800 r/min，然后棄上清液，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12星形膠質細胞培養液2 ml，之后用槍頭反復吹打細胞懸液使其重懸均勻。將細胞密度調整為5×10/ml，分裝接種到培養瓶，置于37 ℃、5%CO細胞培養箱內培養。培養至第14天，將細胞瓶固定于37 ℃恒溫搖床，120 r/min振蕩18 h。棄去培養基，以新鮮的培養基洗滌培養瓶2遍。加入胰酶，當細胞由多角形變成圓形，細胞間隙變大，胞體變亮，小心棄去胰酶。加入新鮮的培養基將細胞重懸成單細胞懸液，置于37 ℃、5%CO培養箱內繼續培養。

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星形膠質細胞的鑒定 待細胞融合度達到80%左右時，經4%多聚甲醛室溫固定、0.3% TritonX-100室溫下通透，正常羊血清工作液室溫封閉后，加入兔抗GFAP單克隆抗體，4 ℃過夜，再加入FITC標記的羊抗兔IgG，避光保存，室溫孵育1 h。DAPI避光孵育染核20 min，滴加抗熒光淬滅封片甘油，封片后熒光顯微鏡觀察。

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A2型RAS的制備及鑒定 取對數生長期的星形膠質細胞，在細胞培養基中加入終濃度為10 ng/ml的IL-1β，放入37 ℃、5%CO培養箱中繼續培養。細胞培養3 d后，行免疫熒光染色，方法同上，所用一抗為兔抗GFAP單克隆抗體和小鼠抗S100A10單克隆抗體，二抗為FITC標記的羊抗兔IgG和TRITC標記的羊抗小鼠IgG。以未經IL-1β處理的星形膠質細胞為對照組。

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CCK-8實驗 取生長正常的A2型RAS接種至96孔板中，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的(0、0.5、1、2 μg/ml)MANF蛋白，放入37 ℃、5%CO培養箱中培養24 h后，棄各孔培養基，向每孔加入90 μl培養基、10 μl CCK-8溶液繼續培養4 h。而后再用酶標儀測定450 nm處的吸光度，該實驗重復3次。采取同上的方法，加入終濃度1 μg/ml MANF蛋白，分別在12、24、36、48 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度，該實驗重復3次。

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5-乙炔基-2-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)摻入試驗 取生長狀態正常的A2型RAS接種至24孔板中，細胞貼壁后分3組進行試驗，空白組只加細胞，Control組加入2×的EdU，MANF組加入2×的EdU和終濃度1 μg/ml的MANF蛋白，繼續培養24 h后進行熒光檢測。該實驗重復3次。

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TUNEL實驗 取生長狀態正常的A2型RAS接種至24孔板中，細胞貼壁后分為2組，空白對照組不做任何處理，MANF組加入終濃度1 μg/ml的MANF蛋白，繼續培養24 h后，加入TUNEL檢測液孵育60 min后進行熒光檢測。該實驗重復3次。

2 結果

2.1 大鼠脊髓星形膠質細胞的培養與鑒定

大鼠脊髓星形膠質細胞分離培養14 d后用倒置顯微鏡觀察細胞基本鋪滿培養皿底(圖1A)，將細胞瓶固定于37 ℃恒溫搖床，120 r/min振蕩18 h后傳代，第2天可見純化的星形膠質細胞呈星形，從胞體發出許多長而分支的突起(圖1B)。免疫熒光結果顯示絕大多數細胞呈GFAP陽性，顯綠色熒光(圖2)即為星形膠質細胞。DAPI染核，胞核呈藍色，為總細胞數，可見星形膠質細胞純度較高。

圖1 大鼠脊髓星形膠質細胞 ×40A:星形膠質細胞原代14 d；B：純化后傳代2d的星形膠質細胞

圖2 星形膠質細胞的鑒定 ×100

2.2 A2型RAS的鑒定

根據A2型RAS特定表達S100A10的特性，應用細胞免疫熒光方法染色結果顯示IL-1β處理的實驗組可見A2型RAS特異性蛋白S100A10被染成紅色，未處理空白對照組僅有少量紅色，DAPI復染后細胞核呈藍色，提示絕大多數細胞為A2型RAS。見圖3。

圖3 A2型RAS細胞的鑒定 ×100

2.3 MANF蛋白對A2型RAS增殖具有時間和濃度依賴性

CCK-8結果顯示，不同濃度的MANF蛋白(0.5、1、2 μg/ml)對A2型RAS具有促進增殖的作用(圖4A)，而且不同作用時間(12、24、36、48 h)促進增殖的能力不同(圖4B)，呈時間和濃度依賴性(

P

<0.05)；當濃度達到2 μg/ml時促增殖的效果最好，與對照組比較差異有統計學意義(

t

=9.951，

P

<0.05)，在12 h的細胞增殖活力與對照組相比，差異無統計學意義。

圖4 MANF蛋白對A2型RAS增殖的影響A：不同濃度MANF對A2型RAS的影響 ；B：不同作用時間對A2型RAS的影響 ；與Control組比較：*P<0.05

2.4 MANF蛋白對A2型RAS增殖有促進作用

為了研究MANF對A2型RAS增殖的影響，進行了EdU摻入試驗，分析細胞增殖情況。結果顯示與對照組(25.5%)相比，MANF組(44.5%)的EdU陽性細胞數量增加了(圖5、6)，這些數據表明MANF對A2型RAS增殖具有促進作用。

圖5 EdU檢測細胞增殖的效果圖 ×100

圖6 EdU陽性細胞所占的比例與Control組比較： **P<0.01

2.5 MANF蛋白對A2型RAS凋亡具有抑制作用

為了研究MANF對A2型RAS的凋亡的影響，因此，進行TUNEL分析細胞凋亡的情況。圖7為倒置顯微鏡下明場拍攝的A2型RAS，圖8為TUNEL染色陽性細胞，與Control組(凋亡的陽性對照)細胞相比，MANF組的細胞中僅觀察到少量TUNEL陽性染色，這表明MANF可以抑制細胞凋亡。

圖7 TUNEL檢測細胞凋亡的效果圖 ×200

圖8 凋亡細胞所占比例與Control組比較：*P<0.05

3 討論

星形膠質細胞在中樞神經系統中所占的比例最大，是維持中樞神經系統結構和生理功能的基礎。星形膠質細胞對缺血、感染、創傷及退行性改變等各種形式的中樞神經系統損害都能迅速做出反應，在形態和功能上發生劇烈的變化，形成RAS。最近，有研究者在制備了炎性和缺血性病變兩種不同性質的中樞神經系統損傷小鼠模型后，分離培養兩種損傷模型小鼠的RAS，研究者將炎性病變誘導產生的RAS命名為A1型RAS，缺血性病變誘導產生的RAS命名為A2型RAS。其中A1型RAS上調許多經典的補體級聯基因，這些基因對突觸具有破壞性，因此推測A1型RAS可能發揮消極的作用。而A2型RAS能夠分泌多種神經營養因子，因此推測A2型RAS可能發揮積極的作用。有研究表明，A2型RAS能夠促進抗炎細胞因子轉化生長因子β的表達。該因子有助于軸突形成和神經保護的作用。

大量的證據表明MANF在多種疾病中均具有保護作用，包括腦缺血、心肌梗塞、視網膜變性。最近有研究證明其可通過抑制眼部組織炎性細胞因子的表達，從而抑制自身免疫性葡萄膜炎。體外細胞培養實驗同樣證明MANF蛋白能夠激活促存活信號通路。本研究以大鼠脊髓星形膠質細胞為研究對象，通過對A2型RAS的制備，觀察不同濃度MANF對A2型RAS增殖活力的影響，結果顯示，MANF可促進脊髓A2型RAS增殖并抑制其凋亡，從而發揮神經修復作用。本研究可能為脊髓損傷的治療提供一個新的思路，但本研究也存在著一定的不足，MANF對促進A2型RAS增殖并抑制其凋亡具體分子機制尚未明確，后續還需進行更深入的研究。