乳鐵蛋白六肽降低人卵巢癌細(xì)胞的耐藥性及其機(jī)制

劉 會，郭若文，徐 恰，劉力偉，劉 蕓，秦宜德

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中最致命的惡性腫瘤，目前臨床上使用的治療方法仍然是手術(shù)結(jié)合化療，但是由于卵巢癌極易復(fù)發(fā)和容易產(chǎn)生耐藥性，所以其預(yù)后很差，患者的5年生存率只有30%左右，降低卵巢癌對化療藥物的耐藥性是當(dāng)前針對卵巢癌治療的主要研究方向。乳鐵蛋白六肽(lactoferrin hexapeptide，LfcinB 4-9)來源于牛乳鐵蛋白抗菌肽(bovine lactoferricin，LfcinB)，是乳鐵蛋白抗菌肽的活性中心，具有多種生物學(xué)活性，其序列為RRWQWR。前期研究顯示LfcinB 4-9具有抗卵巢癌的作用，雖然作用效果不及目前臨床上一線抗癌藥物-順鉑(cis-dichlorodiammine platinum，DDP)，但其沒有副作用和耐藥性而廣受關(guān)注。LfcinB 4-9和DDP聯(lián)合使用能否降低卵巢癌細(xì)胞的耐藥性，增強(qiáng)卵巢癌對DDP的敏感性仍有待探討。該研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過LfcinB 4-9和DDP聯(lián)合作用對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響來探索LfcinB 4-9能否改善卵巢癌細(xì)胞對DDP的耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

純度為99.8%的LfcinB 4-9由上海生工公司合成；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(FBS，上海四季青公司)；DDP(江蘇南通諾欣藥業(yè)公司)；Olaparib(D1810190，上海阿拉丁公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622，美國Thermo Fisher公司);qRT-PCR試劑盒(A6001，美國Promega公司)；Transwell板(美國Costar公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、SKOV3/DDP、CI3K、CI3K/DDP均購于中科院細(xì)胞庫。SKOV3、SKOV3/DDP使用FBS濃度為10%的DMEM培養(yǎng)基，加入1%的雙抗，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CI3K、CI3K/DDP使用FBS濃度為10%的RPMI-1640培養(yǎng)基，加入1%的雙抗，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于96孔板，每組6個復(fù)孔，培養(yǎng)過夜后。分為8組：對照組、5 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC)組、DDP(IC)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC)+5 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9組，Olaparib(IC)組、DDP(IC)+Olaparib(IC)組，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μl MTT置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。使用酶標(biāo)儀檢測吸光度(optical density,OD)值，以空白為對照組，按照計算公式：增殖抑制率(%)=(1-OD/OD)×100%，計算卵巢癌細(xì)胞增殖抑制率。

1.4 HE細(xì)胞染色觀察細(xì)胞形態(tài)

將爬片用高錳酸鉀浸泡過夜、滅菌、烘干置于6孔板底部，將細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，鋪在6孔板底部制成細(xì)胞爬片，過夜。按照分組加藥培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3遍，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min,PBS洗滌3遍，加入0.7% Triton X-100通透10 min后，PBS洗滌3遍。去離子水洗滌2遍，蘇木精染色7 min，50 ℃水藍(lán)化4 min,伊紅溶液染色5 min，最后清水洗滌干凈，烘干封片拍照。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以1 000個每孔鋪于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，按照分組加藥培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周。將培養(yǎng)基棄去，用PBS洗滌3遍，用4%的多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色，清水洗滌干凈拍照，以對照組計算克隆抑制率，公式為：用藥組克隆抑制率(%)=1-(用藥組形成的克隆數(shù)/空白對照組形成的克隆數(shù))×100%。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

將BD基質(zhì)膠按照比例配置好加入小室中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中待凝固，將2×10個細(xì)胞重懸于100 μl無血清培養(yǎng)基中加至Transwell小室膜上，在小室下方加入含10% FBS的培養(yǎng)基500 μl，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用PBS洗滌小室2次，用4%的多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色，清水洗滌干凈拍照。

1.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

按照分組處理細(xì)胞48 h，消化收集、裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中操作步驟采用兩步法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，包括總RNA 2 μl、Oligo(DT) 2 μl、水9 μl，65 ℃反應(yīng)5 min,置于冰上。加入5×RB 4 μl、RI 1 μl、dNTP(10 mmol/L) 2 μl、RT 1 μl,最終體積為20 μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42 ℃、60 min，70 ℃、5 min，生成cDNA，并以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒配置反應(yīng)體系加入到八連管中，按照3步進(jìn)行反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性300 s，以95 ℃變性20 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s進(jìn)行40個循環(huán)。每組設(shè)置3個復(fù)孔，以β-actin引物為內(nèi)參，目的引物序列見表1，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得Ct值,以2公式計算基因的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 引物序列

2 結(jié)果

2.1 LfcinB 4-9對DDP抑制卵巢癌細(xì)胞增殖作用的影響

DDP、Olaparib作用于4種細(xì)胞各時間段的IC見表2。通過不同濃度的LfcinB 4-9和DDP IC聯(lián)合作用于人卵巢癌細(xì)胞，以O(shè)laparib作為陽性對照，結(jié)果表明細(xì)胞的增殖抑制率隨著LfcinB 4-9濃度增大而顯著增高，表現(xiàn)出與時間呈依賴關(guān)系(

F

=841.1、

F

=474.5、

F

=614.2、

F

=290.5)。LfcinB4-9聯(lián)合DDP組與單獨(dú)使用DDP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05或

P

<0.01)。見圖1。

圖1 MTT檢測聯(lián)合用藥對4種細(xì)胞增殖能力的影響A：SKOV3；B：SKOV3/DDP；C：CI3K；C：CI3K/DDP；a：對照組；b：5 μmol/L LfcinB 4-9組；c：DDP(IC50)組；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9組；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9組；g：Olaparib(IC50)組；h：DDP(IC50)+Olaparib(IC50)組；與對照組比較：**P<0.01;與DDP(IC50)組比較：#P<0.05，##P<0.01

表2 DDP、Olaparib作用于4種細(xì)胞各時間段的IC50(mmol/L)

2.2 LfcinB4-9對DDP誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡和壞死的影響

通過HE細(xì)胞染色切片觀察細(xì)胞形態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LfcinB4-9聯(lián)合DDP組與單獨(dú)使用DDP組相比，更能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。LfcinB4-9聯(lián)合DDP組的SKOV3、SKOV3/DDP、CI3K、CI3K/DDP人卵巢癌細(xì)胞經(jīng)染色均表現(xiàn)為核藍(lán)漿紅, 核大深染, 細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比值增大。其中CI3K、CI3K/DDP細(xì)胞的胞核及胞質(zhì)著色較于SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞深, 耐藥株細(xì)胞較于不耐藥株細(xì)胞染色顏色更偏紫紅，見圖2。

圖2 HE細(xì)胞切片實(shí)驗(yàn)檢測聯(lián)合用藥對人卵巢細(xì)胞形態(tài)的影響 ×100A:SKOV3 ;B:SKOV3/DDP ;C:CI3K ;D:CI3K/DDP； a：對照組；b：5 μmol/L LfcinB 4-9組；c：DDP(IC50)組；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9組；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9組；g：Olaparib(IC50)組；h：DDP(IC50)+ Olaparib(IC50)組

2.3 LfcinB 4-9對DDP抑制卵巢癌細(xì)胞克隆形成的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對照組比較，加藥組細(xì)胞克隆形成能力顯著降低，且LfcinB4-9聯(lián)合DDP組與單獨(dú)使用DDP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.01)，見圖3。

圖3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測聯(lián)合用藥對人卵巢細(xì)胞細(xì)胞克隆形成能力的影響 ×100A：對照組；b：5 μmol/L LfcinB 4-9組；c：DDP(IC50)組；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9組；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9組；g：Olaparib(IC50)組；h：DDP(IC50)+Olaparib(IC50)組；與對照組比較：**P<0.01;與DDP(IC50)組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4 LfcinB 4-9對DDP抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響

通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示加藥培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，和單獨(dú)使用DDP組比較，LfcinB4-9聯(lián)合DDP組細(xì)胞侵襲能力明顯下降(

P

<0.01)，見圖4。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測聯(lián)合用藥對人卵巢細(xì)胞侵襲能力的影響 ×100A：對照組；b：5 μmol/L LfcinB 4-9組；c：DDP(IC50)組；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9組；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9組；g：Olaparib(IC50)組；h：DDP(IC50)+ Olaparib(IC50)組；與對照組比較：**P<0.01;與DDP(IC50)組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.5 LfcinB 4-9對人卵巢癌細(xì)胞的OPTN、HSF1、HSP70基因表達(dá)的影響

用qRT-PCR檢測人卵巢細(xì)胞中OPTN、HSF1、HSP70的mRNA水平。結(jié)果顯示，OPTN基因在聯(lián)合用藥組的表達(dá)水平低于單獨(dú)使用DDP組(

P

<0.05或

P

<0.01)，HSF1和HSP70在聯(lián)合用藥處理后表達(dá)量明顯降低且低于單獨(dú)使用DDP組，表明在聯(lián)合處理后相關(guān)基因表達(dá)均被抑制。在SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞株中基因表達(dá)量比在CI3K、CI3K/DDP細(xì)胞株中略高。見圖5。

圖5 聯(lián)合用藥后四種細(xì)胞中OPTN、HSF1、HSP70基因的表達(dá)情況A:SKOV3;B:SKOV3/DDP;C:CI3K;D:CI3K/DDP； a：對照組；b：5 μmol/L LfcinB 4-9組；c：DDP(IC50)組；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9組；f：DDP(IC50)+50 μmol/L LfcinB 4-9組；g：Olaparib(IC50)組；h：DDP(IC50)+Olaparib(IC50)組；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01;與DDP(IC50)組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

DDP是目前臨床上治療卵巢癌通用的一線藥物，但由于耐藥性的出現(xiàn)，使得治療效果降低，臨床上卵巢癌病死率逐年遞增。所以急需降低卵巢癌對順鉑的耐藥性，提高患者生存率。

本實(shí)驗(yàn)顯示不同濃度的LfcinB 4-9與DDP的IC聯(lián)合作用于人卵巢癌細(xì)胞，結(jié)果表明，LfcinB 4-9可以增強(qiáng)DDP對人卵巢癌細(xì)胞的作用，提高卵巢癌細(xì)胞對DDP的敏感性，但相關(guān)的具體機(jī)制比較復(fù)雜，還需要進(jìn)一步探索。化療耐藥是一種多基因多水平多種因素共同作用的過程，有多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子和途徑涉及藥物耐藥性，其中包括多藥耐藥基因(

MDR

1)、Bcl-2蛋白家族、AKT等凋亡相關(guān)基因。相關(guān)研究表明

MDR

1在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)是產(chǎn)生腫瘤耐藥性以致化療失敗的重要原因，

MDR

1編碼一種跨膜相關(guān)的糖蛋白，類似于ATP依賴性的外排泵能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的藥物泵出體外，從而提高細(xì)胞耐藥性，而

OPTN

基因的表達(dá)下降或不表達(dá)能夠影響

MDR

1基因的表達(dá)上升。Bcl-2蛋白家族可以通過抑制毒性刺激后的細(xì)胞凋亡來誘導(dǎo)化學(xué)療法的耐藥性，從而防止細(xì)胞死亡。相關(guān)研究顯示，Bcl-2-a1在細(xì)胞系中的過度表達(dá)可增強(qiáng)對不同癌癥藥物的耐藥性，而

OPTN

基因的表達(dá)下降或不表達(dá)能夠影響B(tài)cl-2基因的表達(dá)上升。

AKT

基因參與線粒體介導(dǎo)的各種途徑的細(xì)胞凋亡, 通過磷酸化或者直接作用于細(xì)胞死亡因子來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。而相關(guān)研究表明

OPTN

基因可能通過抑制AKT蛋白表達(dá), 從而借助于PI3K/AKT途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。人

OPTN

基因位于10號染色體上，由5′UTR中的3個非編碼外顯子和13個外顯子組成，其表達(dá)的蛋白OPTN有577個氨基酸，大小為66 ku。OPTN具有膜運(yùn)輸、維護(hù)高爾基體、胞吐作用和蛋白質(zhì)分泌、細(xì)胞分裂控制等多種作用，在有關(guān)研究中OPTN被鑒定為選擇性自噬受體，可與多泛素化的底物結(jié)合，并將它們帶到和微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light 3，LC3)相互作用區(qū)的自噬體，可用于清除藥物、受損的線粒體和在ER處降解蛋白簇等功能。從公開可用的人類癌癥數(shù)據(jù)中查找到，

OPTN

基因在癌細(xì)胞均高表達(dá)，這與患者的生存率降低有關(guān)，同時也可能使

OPTN

成為有吸引力的治療靶標(biāo)，對于腫瘤發(fā)生或腫瘤干性，在Ser177處OPTN的磷酸化起著關(guān)鍵作用，并在有絲分裂中起到巨大作用且誘導(dǎo)OPTN易位進(jìn)入核，從而克服耐藥性和更具攻擊性的癌癥，本實(shí)驗(yàn)中研究

OPTN

基因?qū)β殉舶┘?xì)胞的增殖與耐藥機(jī)制的影響，并從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出

OPTN

基因的表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，降低了腫瘤細(xì)胞的耐藥性，將為臨床上的治療提供重要理論依據(jù)。

熱休克蛋白家族(heat shock proteins，HSP)是轉(zhuǎn)錄程序中主要的調(diào)控因子，作為分子伴侶，促進(jìn)其他蛋白質(zhì)的折疊、組裝、運(yùn)輸和降解。相關(guān)研究表明熱休克因子1(heat shock transcription factor1，HSF1)、熱休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)在卵巢癌細(xì)胞中的高表達(dá)可能與癌癥的形成與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，HSF1、HSP70在癌細(xì)胞中的高表達(dá)可能通過提供對化學(xué)療法的抗性而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，在相關(guān)研究中表明HSF1不僅借助于保護(hù)癌癥中的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)而起著一般促癌因子的作用，并且還起到破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和引起淀粉樣蛋白生成，可能是對抗惡性腫瘤的一種新型治療策略。HSP則可以通過外泌體被分泌到細(xì)胞外。胞外的HSP不僅可以通過外切體介導(dǎo)的傳輸誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子，也可以抑制蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集在受體細(xì)胞，通過HSP的非細(xì)胞自主作用，HSF1可通過產(chǎn)生炎性微環(huán)境并維持腫瘤的整體蛋白質(zhì)組學(xué)穩(wěn)定性來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

由于LfcinB 4-9對正常細(xì)胞無毒性且來源廣泛，因而在臨床上有廣闊的應(yīng)用前景，也為卵巢癌化療輔助藥物研發(fā)提供了新的方向。