IL-15對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞的影響

汪 昊，徐 斌，魏松松，徐洪港，王 瑞，吳 磊，李 博

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，OA以滑膜炎癥和軟骨破壞為特征，OA在早期階段，其關(guān)節(jié)內(nèi)部發(fā)生的分解作用和抗炎合成過程也在持續(xù)發(fā)生，其中關(guān)鍵作用是免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的相互作用，所以細(xì)胞因子在OA的進(jìn)展中起著重要作用。有研究顯示OA患者滑膜中有大量NK細(xì)胞浸潤，且NK細(xì)胞比例隨著疾病嚴(yán)重程度的增加而上升，提示了NK細(xì)胞確實參與了OA的進(jìn)展。NK細(xì)胞能夠通過釋放細(xì)胞因子如干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)促進(jìn)炎癥的發(fā)生。前期的預(yù)實驗顯示膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)患者外周血中白細(xì)胞介素15(interleukin-15，IL-15)水平高于健康對照者。該研究主要分析IL-15對KOA患者和健康對照者外周血中NK細(xì)胞受體及單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

KOA外周血標(biāo)本取自30例安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院患有KOA的住院患者，其中男14例，女16例，年齡61～74(66.83±4.07)歲，所有患者均符合KOA診療指南(2018年版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，健康對照(healthycontrol, HC)組外周血來源于35例招募的無KOA病史的志愿者，男20例，女15例，年齡18～49(33.65±7.91)歲，受試者的篩選均經(jīng)高年資醫(yī)師確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 膝關(guān)節(jié)感染患者；② 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者；③ 紅細(xì)胞沉降率、類風(fēng)濕因子升高患者；④ 滑膜炎癥患者；⑤ 近期服用非甾體類抗炎藥患者。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

基因重組人IL-15、BV510標(biāo)記的CD3單克隆抗體、BV421標(biāo)記的CD56單克隆抗體、FITC標(biāo)記的CD69單克隆抗體、PE-CY7標(biāo)記的CD69單克隆抗體、PE標(biāo)記的CD94單克隆抗體、APC標(biāo)記的NKG2D單克隆抗體均購自美國BD公司；淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國HyClone公司、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國HyClone公司；青霉素、鏈霉素購自杭州市四季青生物技術(shù)有限公司；IL-15、TNF-α及IFN-γ的ELISA定量試劑盒購自上海江萊生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

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1

PBMCs的制備和細(xì)胞培養(yǎng) 從存放外周血的乙二胺四乙酸(EDTA)管中取出4 ml新鮮外周血，用等體積0.9%氯化鈉溶液稀釋，并緩慢加入至4 ml Ficoll溶液表面，2 000 r/min離心 30 min，輕輕吸出中間白色薄膜狀細(xì)胞層，加入PBS重懸，1 800 r/min離心洗2遍后，即可得到高純度的PBMCs。用0.4%錐蟲藍(lán)溶液染色后用細(xì)胞計數(shù)儀檢測細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞數(shù)，并用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×10/ml加入到24孔板中，將KOA組分為兩組，一是實驗組加入IL-15(10 ng/ml)，二是不加IL-15作為本組對照組。將HC組也分為兩組，一是實驗組加入IL-15(10 ng/ml)，二是不加IL-15作為本組對照組。將培養(yǎng)板放置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

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CCK-8檢測PBMCs增殖能力 取提純得到的高純度PBMCs，接種細(xì)胞懸液(5 000個/孔)于96孔板中，實驗組加入 IL-15(10 ng/ml)，對照組加等量完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在每孔內(nèi)加入10 μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)板放置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值，該實驗重復(fù)3次。

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3

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3

流式細(xì)胞儀檢測外周血NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)情況 培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液中加入BV510-CD3、BV421-CD56、FITC-CD69、PE-CY7-CD69、PE-CD94、APC-NKG2D避光共孵育30 min，以分析NK細(xì)胞表面受體CD69、CD94和NKG2D的表達(dá)狀況，采用Beckman Coulter流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，用CytExpert軟件進(jìn)行分析。

1

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3

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4

細(xì)胞因子測定 空腹采集前臂靜脈血3 ml，待試管中血液凝血后吸取試管中的上清液，3 000 r/min離心10 min，標(biāo)本于-80 ℃保存。將PBMCs培養(yǎng)24 h后保留的上清液標(biāo)本 3 000 r/min離心10 min，標(biāo)本于-80 ℃保存。兩者均應(yīng)用ELISA法檢測，分析方法和操作步驟按說明書進(jìn)行，最低檢測濃度小于 0.1 pg/ml。

2 結(jié)果

2.1 KOA組與HC組外周血IL-15的水平

KOA組外周血清中IL-15水平與HC組比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=8.598，

P

<0.01)。見圖1。

圖1 兩組外周血中IL-15水平比較與HC組比較：**P<0.01

2.2 IL-15對兩組PBMCs增殖能力的影響

結(jié)果顯示IL-15對KOA組與HC組PBMCs的增殖能力并無影響，說明IL-15對NK細(xì)胞表面受體和PBMCs分泌細(xì)胞因子的影響并非由細(xì)胞增殖引起的，而是IL-15通過對細(xì)胞的刺激引起的。見圖2。

圖2 CCK-8實驗檢測IL-15對兩組PBMCs增殖能力的影響A：IL-15對HC組PBMCs增殖能力影響的半定量分析；B：IL-15對KOA組PBMCs增殖能力影響的半定量分析

2.3 IL-15對NK細(xì)胞CD69、CD94、NKG2D表達(dá)的影響

2

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3

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1

IL-15對NK細(xì)胞CD69表達(dá)的影響 圖3結(jié)果顯示未加IL-15(10 ng/ml)培養(yǎng)的KOA組與HC組NK細(xì)胞表面受體CD69的表達(dá)基本沒有變化。經(jīng)IL-15(10 ng/ml)刺激培養(yǎng)后分別增強了HC組NK細(xì)胞表面受體CD69的表達(dá)(

t

=6.181，

P

<0.01)和KOA組NK細(xì)胞表面受體CD69的表達(dá)(

t

=7.085，

P

<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明IL-15能夠升高NK細(xì)胞表面受體CD69的表達(dá)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞表面受體CD69+的表達(dá)和CD69+NK細(xì)胞半定量分析圖與對照組比較：**P<0.01

2

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3

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2

IL-15對NK細(xì)胞CD94表達(dá)的影響 圖4結(jié)果顯示未加IL-15(10 ng/ml)培養(yǎng)的KOA組與HC組NK細(xì)胞表面受體CD94的表達(dá)基本沒有變化，經(jīng)IL-15(10 ng/ml)刺激培養(yǎng)后分別增強了HC組NK細(xì)胞表面受體CD94的表達(dá)(

t

=3.033，

P

<0.01)和KOA組NK細(xì)胞表面受體CD94的表達(dá)(

t

=2.764，

P

<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明IL-15能夠升高NK細(xì)胞表面受體CD94的表達(dá)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞表面受體CD94+的表達(dá)和CD94+NK細(xì)胞半定量分析圖與對照組比較：**P<0.01

2

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3

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3

IL-15對NK細(xì)胞NKG2D表達(dá)的影響 圖5結(jié)果顯示未加IL-15(10 ng/ml)培養(yǎng)的KOA組比HC組NK細(xì)胞表面受體NKG2D的表達(dá)明顯升高(

t

=4.007，

P

<0.01)，經(jīng)IL-15(10 ng/ml)刺激培養(yǎng)后分別增強了HC組NK細(xì)胞表面受體NKG2D的表達(dá)(

t

=9.752，

P

<0.01)和KOA組NK細(xì)胞表面受體NKG2D的表達(dá)(

t

=6.107，

P

<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明IL-15能夠升高NK細(xì)胞表面受體NKG2D的表達(dá)。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞表面受體NKG2D+的表達(dá)和NKG2D+NK細(xì)胞半定量分析圖與對照組比較：**P<0.01

2.4 加入IL-15(10 ng/ml)培養(yǎng)后兩組PBMCs上清液中TNF-α、IFN-γ的表達(dá)含量

圖6顯示KOA患者的PBMCs經(jīng)培養(yǎng)后上清液中TNF-α和IFN-γ的含量均比HC組升高。圖6A和圖6C結(jié)果顯示HC組加入IL-15(10 ng/ml)細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液中IFN-γ(

t

=3.554，

P

<0.01)和TNF-α(

t

=4.144，

P

<0.01)的含量比未加入的HC組明顯升高。圖6B和圖6D結(jié)果顯示KOA組加入IL-15(10 ng/ml)細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液IFN-γ(

t

=10.19，

P

<0.01)和TNF-α(

t

=8.177，

P

<0.01)的含量比未加入的HC組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明IL-15能夠提高KOA患者和健康對照者PBMCs產(chǎn)生TNF-α和IFN-γ的能力，且KOA患者的PBMCs對IL-15的刺激反應(yīng)性更強。

圖6 加入IL-15培養(yǎng)后兩組PBMCs上清液中TNF-α、IFN-γ的表達(dá)含量A：HC組細(xì)胞培養(yǎng)后上清液中IFN-γ的半定量分析圖；B：KOA組細(xì)胞培養(yǎng)后上清液中IFN-γ的半定量分析圖；C：HC組細(xì)胞培養(yǎng)后上清液中TNF-α的半定量分析圖；D：KOA患者細(xì)胞培養(yǎng)后上清液中TNF-α的半定量分析圖；與對照組比較：**P<0.01

3 討論

首先通過對KOA組和HC組外周血IL-15的測定來分析兩者是否存在差異性，實驗結(jié)果顯示KOA患者外周血IL-15水平明顯高于HC組。所以KOA患者外周血中升高的IL-15可能參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。

根據(jù)NK細(xì)胞表面CD56分子的密度，NK細(xì)胞可分為CD56和CD56兩個亞群。CD56NK細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，CD56NK細(xì)胞能夠產(chǎn)生豐富的細(xì)胞因子，NK細(xì)胞可能通過其細(xì)胞毒性和釋放細(xì)胞因子參與OA的進(jìn)展。然而NK細(xì)胞的效應(yīng)功能受激活和抑制受體信號之間的平衡調(diào)節(jié)。其中CD69是NK細(xì)胞表面一種激活型受體，可在細(xì)胞被激活后迅速誘導(dǎo)表達(dá)，由于CD69NK細(xì)胞能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放TNF-α，因此被認(rèn)為是促進(jìn)炎癥產(chǎn)生的一種表達(dá)受體，并可能同時啟動由NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫攻擊。在加入IL-15(10 ng/ml)培養(yǎng)的情況下KOA組和HC組NK細(xì)胞的CD69受體表達(dá)均升高。說明在IL-15升高的情況下，NK細(xì)胞被激活，其細(xì)胞表面的CD69受體迅速表達(dá)，進(jìn)而可能引起NK細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子來促進(jìn)或抑制其他免疫細(xì)胞的功能。

NKG2D是能識別癌細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞表達(dá)的應(yīng)激誘導(dǎo)配體，對提高NK細(xì)胞毒性至關(guān)重要。在未加入IL-15(10 ng/ml)培養(yǎng)的情況下KOA組NK細(xì)胞表面受體NKG2D的表達(dá)與HC組比明顯升高，說明KOA組的NK細(xì)胞可能已經(jīng)處于某種激活狀態(tài)。在加入IL-15(10 ng/ml)后，KOA組和HC組NK細(xì)胞表面受體NKG2D的表達(dá)均升高，說明IL-15能夠升高NK細(xì)胞表面受體NKG2D的表達(dá)，從而可能提高NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性來參與KOA的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

CD94是NK細(xì)胞上表達(dá)的一種抑制性受體，然而在許多情況下抑制信號支配激活信號，因此可能通過CD94抑制受體表達(dá)的增多來激活NK細(xì)胞增強其對靶細(xì)胞的反應(yīng)。實驗結(jié)果顯示IL-15能夠增強KOA組和HC組NK細(xì)胞受體CD94的表達(dá)，所以IL-15可能通過增加CD94的表達(dá)從而調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能進(jìn)而參與KOA的發(fā)生與發(fā)展。

實驗結(jié)果顯示加入IL-15(10 ng/ml)細(xì)胞培養(yǎng)后上清液中的TNF-α和IFN-γ的水平均顯著增高，且KOA組加入或者未加入IL-15的結(jié)果均比HC組明顯升高，說明KOA患者的PBMCs已經(jīng)發(fā)生某些改變，促使KOA患者的PBMCs對IL-15的刺激敏感性更高，并且分泌細(xì)胞因子的能力提高，這可能與KOA的疾病狀態(tài)有關(guān)系。已有研究表明TNF-α在OA的發(fā)病機制中起著重要作用，其通過刺激蛋白酶和PGE2的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生其他細(xì)胞因子，導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織加速損傷。TNF-α和IFN-γ也可以通過誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生從而抑制Ⅱ型膠原的產(chǎn)生，并通過增加MMPs組酶的產(chǎn)生促進(jìn)KOA的發(fā)生與發(fā)展。由此可以看出TNF-α和IFN-γ對OA的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。而KOA患者本身外周血升高的IL-15可能是疾病發(fā)生的一個重要環(huán)節(jié)，可通過進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α和IFN-γ炎性細(xì)胞因子水平的產(chǎn)生來加速KOA的發(fā)生與發(fā)展。