氯氮平對雄性C57BL/6小鼠淀粉酶和促炎性細胞因子表達的影響

趙彤彤 ，寧曉帥，楊亞婷，張雨龍，任振華，劉寰忠

精神分裂癥是一種常見的、嚴重危害人類健康的精神疾病，其中難治性精神分裂癥至少占到20%，氯氮平是治療難治性精神分裂癥的首選藥物。但其臨床應用受到嚴重不良反應的限制，其中就包括胰腺炎。關于氯氮平導致胰腺損傷的發病機制尚不清楚，有研究顯示促炎性細胞因子在胰腺炎的病程進展中起到重要作用，而血淀粉酶是臨床胰腺炎診斷的首選實驗室檢查項目。該研究旨在探討氯氮平對小鼠血液以及胰腺組織中淀粉酶和促炎性細胞因子表達的影響，以期有助于初步探索氯氮平導致胰腺損傷的發生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1

.

1

.

1

實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠，購于安徽醫科大學實驗動物中心[許可證號SCXK(皖)2017-001]，體質量(20±2)g。分籠飼養于明暗周期為12 h晝夜節律，相對濕度45%左右，室溫(22±2)℃的普通設施中，普通全價鼠飼料喂養，自由進食及飲水，適應性喂養1周后進行實驗。本實驗已獲得安徽醫科大學倫理委員會批準(編號：LLSC20190743)。

1

.

1

.

2

藥品與試劑 氯氮平(上海上藥信誼藥廠有限公司, 批號: H31021152)；水合氯醛(上海生工生物工程有限公司)。RIPA裂解液和BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；ECL超敏發光試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；鼠一抗α-tubulin抗體(T6199)購自美國Sigma-Aldrich公司；兔一抗淀粉酶(amylase)(貨號：ab21156)、白細胞介素(interleukin，IL)-1β(貨號：ab9722)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)(貨號：ab6671)抗體購自英國Abcam公司；兔一抗IL-6抗體(12912S)購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。TRIzol試劑盒(美國Life Technogies公司)；DEPC-HO(上海捷瑞生物工程有限公司)；RevertAid第一鏈 cDNA Synthesis試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒(上海近岸蛋白科技有限公司)；其他試劑為分析純。

1

.

1

.

3

主要儀器 電子天平(上海菁海儀器有限公司)；pH計(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；多功能酶標儀、高速低溫離心機、熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；電泳儀、電泳槽和轉膜儀、化學發光成像儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1

.

2

.

1

模型的制作和標本的處理 48只雄性C57BL/6小鼠按照隨機化原則分為四組，分別為對照組、氯氮平(5、10、20 mg/kg)組。氯氮平充分研磨后加入0.9%氯化鈉溶液，分別配成濃度為0.5、1、2 mg/ml的懸濁液，每次灌胃前充分搖勻。每日在給藥前先稱重每只小鼠的體質量，氯氮平5 mg/kg組的小鼠根據體質量灌胃0.5 mg/ml的懸濁液，氯氮平10 mg/kg組的小鼠根據體質量灌胃1 mg/ml的懸濁液，氯氮平20 mg/kg組的小鼠根據體質量灌胃2 mg/ml的懸濁液，對照組小鼠根據體質量灌胃相應體積0.9%氯化鈉溶液。上述各組小鼠每日上午9:00灌胃1次，連續14 d給予相應劑量藥物。期間各組小鼠飲食自由。末次給藥前禁食不禁水12 h，給藥后再禁食3 h，隨后腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠的麻醉狀態達到最佳時，剖腹打開小鼠胸腔后完全暴露心臟，然后經心臟穿刺采血置于惰性分離膠促凝管內，低溫離心后分離血清置-80 ℃ 冰箱中待測；采血后立即取出小鼠胰腺組織液氮驟冷，置于-80 ℃冰箱保存待用。每組小鼠中的6個胰腺組織用于Western blot實驗，另外6個胰腺組織用于熒光定量PCR實驗。

1

.

2

.

2

小鼠血清amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的測定 血清amylase采用比色分析試劑盒(ab102523)測定，血清IL-1β、IL-6、TNF-α采用ELISA試劑盒(ab197742、ab222503、ab46105)測定。上述試劑盒均購自英國Abcam公司，嚴格按照制造商的說明書操作。

1

.

2

.

3

Western blot測定小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達 從每組小鼠各取6個胰腺組織，每個胰腺組織加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液后冰上勻漿提取蛋白，在冷凍離心機中以12 000 r /min離心15 min，使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。根據蛋白濃度計算每個樣本的上樣量，蛋白樣品與上樣緩沖液體積比4 ∶1混合, 總體積不超過20 μl，用10%SDS-PAGE分離蛋白, 電泳轉移到PVDF膜上，轉膜后用4%BSA室溫封閉2 h。再將膜溶于含4%BSA中的一抗4 ℃緩慢搖動孵育過夜。洗膜后將膜浸入用二抗稀釋液稀釋的二抗中, 室溫下孵育2 h。參考ECL發光試劑盒說明書，使用化學發光儀進行底物顯影曝光拍照，采用ImageJ圖像分析軟件分析灰度值，所有蛋白條帶灰度值均以對應的a-tubulin為基準進行校正, 計算相對灰度值。

1

.

2

.

4

熒光定量PCR測定小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達 從每組小鼠各取6個胰腺組織，剪碎，液氮研磨后，加入TRIzol核酸提取液裂解，冰上勻漿, 按操作說明提取總RNA。室溫干燥RNA沉淀，加入DEPC水, -80 ℃保存備用。按逆轉錄試劑盒說明書在PCR儀上進行逆轉錄反應，制成cDNA。RT反應條件為：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。取出所得的cDNA作為熒光定量的模板，構建反應體系，PCR反應條件為：95 ℃變性1 min, 95 ℃變性20 s, 60 ℃退火1 min，40個循環。讀取目的基因amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α及對應內參基因β-actin的閾值循環數(Ct值), 再采用比較ΔCt值的相對定量法計算目的基因表達水平。PCR引物序列均由上海生工生物工程公司合成(表1)。

表1 引物序列

2 結果

2.1 氯氮平對小鼠外周血amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α表達的影響

如表2所示，氯氮平給藥后小鼠血清amylase水平升高(

F

=7.890,

df

=3,

P

<0.001)；與對照組相比，氯氮平10 mg/kg和20 mg/kg 組血清amylase水平明顯升高(

P

<0.01,

P

<0.001)。氯氮平給藥后小鼠血清IL-1β水平升高(

F

=6.976,

df

=3,

P

<0.01)；與對照組相比，氯氮平5 mg/kg和10 mg/kg組血清IL-1β水平明顯升高(

P

<0.01)；氯氮平20 mg/kg組與對照組相比升高更加明顯(

P

<0.001)。氯氮平給藥后也影響了小鼠血清IL-6的水平(

F

=4.033,

df

=3,

P

<0.05)；與對照組相比，氯氮平5 mg/kg組的IL-6水平有所下降(

P

<0.05)。氯氮平給藥后對小鼠血清TNF-α水平無影響，差異無統計學意義(

F

=0.272,

df

=3,

P

>0.05)。

表2 四組小鼠血清amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α水平的比較

2.2 氯氮平對小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α表達的影響

如圖1、表3所示，氯氮平能上調小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達水平(

F

=95.042,

df

=3,

P

<0.001；

F

=184.349,

df

=3,

P

<0.001；

F

=332.945,

df

=3,

P

<0.001；

F

=219.696,

df

=3,

P

<0.001)。與對照組相比，氯氮平5、10、20 mg/kg組的胰腺組織中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達水平明顯升高(

P

<0.01)。氯氮平給藥后小鼠胰腺組織中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平與它們各自的蛋白表達水平基本一致(

F

=121.605,

df

=3,

P

<0.001；

F

=125.620,

df

=3,

P

<0.001；

F

=70.350,

df

=3,

P

<0.001；

F

=74.281,

df

=3,

P

<0.001)，與對照組相比，氯氮平5、10和20 mg/kg組的胰腺組織中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平明顯升高(

P

<0.01)。見表4。

圖1 四組小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的相對表達量1:對照組；2:氯氮平5 mg/kg組；3:氯氮平10 mg/kg組；4:氯氮平20 mg/kg組

表3 四組小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達水平的比較

表4 四組小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達水平的比較

3 討論

近年來隨著非典型抗精神病藥物的廣泛使用，由抗精神病藥引起的藥物性胰腺炎逐漸引起關注，據美國FDA統計數據表明抗精神病藥中導致胰腺炎報道最多的藥物是氯氮平。氯氮平的用藥起始時間與胰腺炎的發病進一步支持了因果關系，所有患者均表現為血清amylase水平的升高。有研究顯示患者在氯氮平治療初期即會引起免疫介導的炎癥反應，表現為外周血細胞因子的升高。在這期間內，患者被懷疑具有藥物相關副作用的風險達到最高。值得注意的是，對于氯氮平一些其他潛在危及生命的副作用已經提出了免疫介導機制。氯氮平治療后對細胞因子的調節作用并可能伴隨著炎癥副作用的發生，提示免疫機制可能參與氯氮平副作用的發生。

血amylase是臨床胰腺炎診斷的首選實驗室檢查，本研究結果顯示，氯氮平可導致小鼠血清amylase呈劑量依賴性升高。目前關于非典型抗精神病藥對血amylase影響的動物實驗較少，國外僅有1項奧氮平口服給藥的大鼠實驗，研究結果顯示奧氮平導致大鼠血清amylase明顯升高。奧氮平的化學結構和藥理作用與氯氮平類似，是抗精神病藥物中報告胰腺炎發生率僅次于氯氮平的藥物。國內的一項對氯氮平急性中毒患者的研究顯示，一次性大劑量服用氯氮平導致患者的血amylase明顯升高乃至出現高淀粉酶血癥，這進一步提供了藥物本身致病作用的證據并支持了亞臨床性胰腺炎的可能。

胰腺炎作為一種炎癥性疾病，活化的巨噬細胞先誘導胰腺腺泡細胞發生損傷并產生炎癥介質的，其中TNF-α和IL-1β是一階段促炎性因子，它們通過再激活巨噬細胞并調節其他炎癥介質如IL-6的釋放來增強炎癥反應，因此促炎性細胞因子的檢測為評估胰腺損傷的嚴重程度提供了客觀依據。該研究結果顯示氯氮平不僅使小鼠胰腺組織中amylase的表達顯著升高，而且小鼠胰腺組織中促炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平也呈劑量依賴性地升高。這些結果與經典酒精性胰腺炎小鼠模型中的結果一致，更加支持了胰腺組織中炎性介質的逐漸積累直至胰腺炎癥的發生，從而表現為臨床上有癥狀的急性胰腺炎。

本研究表明氯氮平顯著升高了血清IL-1β的水平，這與胰腺組織中IL-1β的表達趨勢一致。IL-1β已被證實在胰腺炎病程進展中起到核心作用，有研究表明通過使用IL-1β轉化酶抑制劑，可以改善急性重癥胰腺炎損傷的嚴重程度。但氯氮平對小鼠血清IL-6和TNF-α表達的影響卻與胰腺組織中的趨勢不一致，氯氮平在低劑量組使血清IL-6降低了，而氯氮平三組對血清TNF-α均無明顯影響。實際上，一直以來關于氯氮平對外周血細胞因子的調節作用并沒有得出一致趨勢的結論，這有待進一步的研究。