敲低MANF對利福平誘導HepG2細胞損傷的影響及機制

戴 瓊，張衛平，陳 剛，王 鵬，許建明，梅 俏

抗結核藥物誘導肝臟產生適應性反應是藥物性肝損傷領域研究的熱點。課題組前期的體外研究發現未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)中的PERK通路介導了利福平(rifampicin，RFP)誘導的適應性反應，同時發現分泌型蛋白中腦星型膠質細胞源性神經生長因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)的表達也發生了改變。UPR由PERK、IRE1和ATF6 3條信號通路組成。有研究報道UPR 3條通路的靶蛋白分子可以調節MANF的表達，過表達ATF6后MANF表達增加，XBP1可以增加MANF的表達。但是MANF對UPR 3條通路是否具有反饋調節作用以使UPR維持在合適的強度未見文獻報道。該研究通過分子生物學技術敲低HepG2細胞的MANF基因，觀察敲低MANF對RFP誘導HepG2細胞損傷及UPR相關基因表達的影響，探討其細胞保護作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

攜帶MANF敲低序列的慢病毒以及空白慢病毒購自和元生物技術(上海)股份有限公司；DMEM高糖細胞培養液購自美國Hyclone公司；胰酶消化酶、胎牛血清購自美國Gibco公司；PVDF膜購自Millipore公司；蛋白Marker、ECL顯影液購自Thermo scientific公司；MANF、非剪接型X-盒結合蛋白1(non-spliced X-box binding protein 1-U, XBP1-U)抗體購自美國Abcam公司；葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)、蛋白酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)、p-PERK、真核翻譯啟動因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α, eIF2α)、p-eIF2α、活化轉錄因子4(activating transcription factor 4, ATF4)、CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)、Tribbles同源蛋白3(Tribbles homolog 3, TRIB3)、肌醇需求激酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)、p-IRE1、剪接型X-盒結合蛋白1(spliced X-box binding protein1-S, XBP1-S)、活化轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)抗體購自美國CST公司；TRIzol購自美國Thermo公司；逆轉錄試劑盒和PCR擴增試劑盒購自日本TaKaRa公司；GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3、IRE1、XBP1-S、XBP1-U、ATF6引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；RFP(R3501)、DMSO購于美國Sigma公司；谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；人間接膽紅素(indirect bilirubin, IBIL) ELISA試劑盒購于上海易利生物科技有限公司；青霉素/鏈霉素、BCA蛋白測定試劑盒、GAPDH抗體、二抗、CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司；PE Annexin V凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司；細胞培養板購于美國TrueLine公司；酶標儀購自美國PE公司(Enspire)；流式細胞儀購于美國貝克曼公司(CytoFLEX)。

1.2 細胞分組及其培養

HepG2細胞購自中國科學院上海分院細胞庫；利用慢病毒轉染技術構建MANF敲低穩轉細胞株(MANF Y25)及其對照細胞株(MANF Y07)，實驗分成4組：MANF Y07+DMSO組、MANF Y07+RFP組、MANF Y25+DMSO組、MANF Y25+RFP組。用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養基培養。在含5% CO、37 ℃的培養箱中培養，每天半量換液，取對數生長期的細胞用于實驗。細胞轉染時采用不含血清及雙抗的DMEM高糖培養基培養。

1.3 慢病毒構建及轉染

將生長至對數生長期的目的細胞胰酶消化后，以每孔5×10個細胞的密度均勻鋪在12孔板上，當細胞生長至匯合度30%～40%時感染慢病毒，同時將培養基更換成不含血清和雙抗的DMEM高糖培養基，培養8～12 h后，更換成含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養，48～72 h后用嘌呤霉素篩選陽性克隆細胞2周左右。

1.4 Western blot檢測蛋白表達水平

將生長至對數生長期的MANF Y07、MANF Y25細胞胰酶消化后，以每孔2.0×10個細胞的密度均勻接種在6孔板上，當細胞生長至匯合度達到70%～80%時，加入100 μmol/L RFP誘導24 h，然后收集各組細胞。用蛋白提取試劑盒提取蛋白，用BCA蛋白測定試劑盒進行蛋白定量，上樣后于SDS-PAGE凝膠上進行電泳、分離，再轉入PVDF膜上轉膜，5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h，再分別加入GAPDH(1 ∶5 000)、MANF、GRP78、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3、p-IRE1、IRE1、XBP1-S、XBP1-U、ATF6抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日PVDF膜恢復室溫后用TBST洗膜5次，每次8 min，分別加入二抗(1 ∶5 000)，于室溫下孵育1 h，再次用TBST洗膜5次，每次8 min，最后加ECL顯影液顯影。GAPDH作為內參，采用Image J軟件分析結果。蛋白表達水平以與內參比值的平均灰度表示。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測MANF及UPR相關基因表達水平

收集100 μmol/L RFP處理后的各組細胞，用TRIzol提取各組細胞中的總RNA。根據逆轉錄試劑盒的操作說明將RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件：37 ℃，15 min(逆轉錄反應)，85 ℃，5 s(逆轉錄酶失活)，4 ℃，然后用PCR擴增試劑盒擴增PCR。擴增條件：變性 95 ℃ 5 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸 60 ℃ 30 s，共40個循環。讀取每個反應的Ct值，以2表示基因相對表達量。所用qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測細胞凋亡率

將生長至對數生長期的MANF Y07、MANF Y25細胞胰酶消化后，以每孔2.0×10個細胞的密度均勻接種在6孔板上，當細胞生長至匯合度達到70%～80%時，加入100 μmol/L RFP誘導24 h，然后收集各組細胞。預冷的PBS洗滌細胞2次，結合緩沖液重懸細胞，再加入5 μl Annexin V-PE 和 7-AAD避光孵育15 min，最后加入200 μl結合緩沖液，1 h內流式細胞儀檢測。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖

取對數生長期的MANF Y07、MANF Y25細胞胰酶消化后，以每孔2.5×10個細胞的密度均勻接種在96孔板上，邊緣孔用無菌PBS填充。當細胞生長至匯合度達到70%～80%時，加入100 μmol/L RFP誘導24 h后，每個孔中分別加入10 μl CCK-8溶液和90 μl的純DMEM培養液，輕輕敲擊培養板，使兩者充分混勻，于37 ℃培養箱中避光孵育1～4 h。使用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度(optical density,OD)值。

1.8 細胞培養上清液中細胞損傷標志物相對含量檢測

收集各組細胞培養上清液(約2 ml)，以3 000 r/min離心10 min。立即測定上清液或儲存在-80 ℃冰箱以備用，注意避免反復凍融以及含有RFP的樣本注意避光保存。分別根據ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL檢測試劑盒的操作說明，設定標準孔、樣品孔、對照孔和空白孔，將各組樣品與試劑盒里的試劑按照要求加到標準孔、樣品孔、對照孔和空白孔中，輕輕敲擊96孔板，使之充分混勻，于37 ℃培養箱中避光孵育一定時間，最后根據各自所要求的波長，用酶標儀測定各組細胞培養上清液所對應的吸光度，根據計算公式或者標準曲線得出各組細胞損傷標志物(ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL)的相對含量。

2 結果

2.1 MANF在HepG2穩轉細胞株中的表達及敲低MANF對GRP78表達的影響

MANF基因敲低效率通過Western blot和qRT-PCR檢測。與對照細胞株(MANF Y07)相比，在MANF敲低穩轉細胞株(MANF Y25)中，MANF蛋白表達減少了約40%(

F

=18.44，

P

<0.05),MANF 基因表達減少了約90%(

F

=1 067.41，

P

<0.01),見圖1，表明MANF敲低穩轉細胞株構建成功。100 μmol/L RFP給藥24 h后可增加MANF的蛋白及基因表達(

P

<0.01)。本研究首先觀察了RFP處理的HepG2細胞中GRP78蛋白及基因表達的變化。Western blot和qRT-PCR分析均表明，RFP處理可上調GRP78蛋白及基因的表達(

P

<0.05，

P

<0.01)，見圖2。MANF敲低前后對比發現，敲低后GRP78蛋白(

F

=15.12，

P

<0.05)及基因(

F

=359.32，

P

<0.01)表達水平進一步升高，表明RFP可以激活GRP78，而在敲低MANF后這種激活效應進一步加強。

圖1 MANF在HepG2穩轉細胞株中的表達A：各組MANF蛋白表達水平；B：MANF的擴增曲線；C：各組MANF基因表達水平；1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：*P<0.05，**P<0.01；與MANF Y07+RFP組比較： △△P<0.01

圖2 敲低MANF對GRP78表達的影響A：各組GRP78蛋白表達水平；B：GRP78的擴增曲線；C：各組GRP78基因表達水平；1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：*P<0.05，**P<0.01；與MANF Y25+RFP組比較：##P<0.01；與MANF Y07+RFP組比較：△P<0.05，△△P<0.01

2.2 MANF敲低對HepG2細胞UPR 3條信號通路的影響

2

.

2

.

1

MANF敲低對HepG2細胞PERK-ATF4-CHOP信號通路的影響 用RFP處理HepG2細胞24 h后，結果如圖3所示，在MANF敲低前，RFP可以誘導p-eIF2α/eIF2α、ATF4的蛋白表達(

P

<0.01)以及PERK(

P

<0.05)、eIF2α(

P

<0.01)、ATF4(

P

<0.01)、CHOP(

P

<0.05)、TRIB3(

P

<0.01)基因表達，MANF基因敲低后發現p-PERK/PERK(

F

=349.3，

P

<0.01)、p-eIF2α/eIF2α(

F

=626.0，

P

<0.01)、ATF4(

F

=87.38，

P

<0.01)的蛋白表達水平進一步升高，同時發現PERK(

F

=121.50，

P

<0.01)、eIF2α(

F

=49.02，

P

<0.01)、ATF4(

F

=48.96，

P

<0.01)、CHOP(

F

=92.99，

P

<0.01)、TRIB3(

F

=35.14，

P

<0.01)的基因表達水平也進一步升高。說明RFP可以激活PERK-ATF4-CHOP信號通路，在敲低MANF后這種激活效應進一步加強。

圖3 MANF敲低對HepG2細胞PERK-ATF4-CHOP信號通路的影響A-E：各組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3蛋白和基因表達水平；1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：*P<0.05，**P<0.01；與MANF Y25+RFP組比較：##P<0.01；與MANF Y07+RFP組比較：△△P<0.01

2

.

2

.

2

MANF敲低對HepG2細胞IRE1-XBP1信號通路的影響 如圖4所示，MANF敲低前后對比發現，MANF敲低后RFP誘導IRE1(

F

=56.04，

P

<0.01)、XBP1-S/XBP1-U(

F

=40.38，

P

<0.01)基因表達水平升高，表明RFP可以激活IRE1-XBP1信號通路，在敲低MANF后這種激活效應進一步加強。

圖4 MANF敲低對HepG2細胞IRE1-XBP1信號通路的影響A、B：各組IRE1、XBP1-S、XBP1-U蛋白和基因表達水平；1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：**P<0.01；與MANF Y25+RFP組比較：#P<0.05，##P<0.01；與MANF Y07+RFP組比較：△△P<0.01

2

.

2

.

3

MANF敲低后對ATF6信號通路的影響 如圖5所示，在MANF敲低前，RFP誘導ATF6蛋白的表達，MANF基因敲低后發現ATF6的蛋白(

F

=364.7，

P

<0.01)和基因(

F

=29.90，

P

<0.01)表達

圖5 MANF敲低后對ATF6蛋白和基因表達的影響1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：**P<0.01；與MANF Y25+RFP組比較：#P<0.05，##P<0.01：與MANF Y07+RFP組比較：△△P<0.01

水平均進一步升高。說明RFP可以激活ATF6信號通路，在敲低MANF后這種激活效應進一步加強。

2.3 MANF敲低后對HepG2細胞損傷的影響

Annexin V-PE/7-AAD雙染法結果顯示：與MANF Y07+RFP組(11.64±0.99)%比較，MANF Y25+RFP組(16.48±1.14)%細胞凋亡率升高(

F

=35.80，

P

<0.01)，見圖6A；CCK-8檢測結果顯示：MANF Y25+RFP組(1.96±0.08)細胞OD值較MANF Y07+RFP組(2.29±0.04)降低(

F

=56.59，

P

<0.01)，見圖6B；細胞培養上清液結果顯示：與MANF Y07+RFP組[(12.87±0.85)、(4.27±0.17)、(2.08±0.02)、(11.53±0.64)、(2.77±0.53)U/L]比較，MANF Y25+RFP組[(29.81±0.85)、(6.58±0.93)、(2.43±0.05)、(15.49±0.59)、(5.97±0.53)U/L]細胞培養上清液中的細胞損傷標志物ALT(

F

=27.97，

P

<0.01)、AST(

F

=14.41，

P

<0.05)、AKP(

F

=46.17，

P

<0.01)、TBIL(

F

=378.58，

P

<0.01)、IBIL(

F

=32.71，

P

<0.01)均升高，見圖6C-6G。表明MANF敲低后加重了RFP誘導的HepG2細胞損傷。

圖6 MANF敲低后對HepG2細胞損傷的影響A：MANF敲低后對HepG2細胞凋亡的影響；B：MANF敲低后對HepG2細胞增殖的影響；C-G：MANF敲低后各組細胞培養上清液中細胞損傷標志物ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL的變化；H：各組HepG2細胞凋亡的流式圖；1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：*P<0.05，**P<0.01；與MANF Y25+RFP組比較：##P<0.01；與MANF Y07+RFP組比較：△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

當機體在毒性藥物、感染、低氧、氧應激等條件誘導下，內質網中未折疊或錯誤折疊的蛋白質聚集導致內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS可以觸發適應性保護機制-UPR，旨在清除未折疊或錯誤折疊的蛋白質來恢復內質網平衡。內質網伴侶蛋白GRP78，是內質網穩態的主要調節因子，對于ERS的啟動非常重要。在非應激條件下，GRP78與跨膜應激傳感器PERK、IRE1和ATF6結合；在應激條件下，錯誤折疊的蛋白質與這些傳感器競爭與GRP78結合，釋放PERK、IRE1和ATF6應激傳感器以激活UPR。隨著ERS時間的延長，PERK多聚化并激活eIF2α磷酸化，促進ATF4的翻譯，從而激活包括CHOP和TRIB3在內的特異性UPR靶基因的轉錄誘導細胞凋亡。持續應激下，IRE1可以通過激活c-jun氨基末端激酶(JNK)通路和招募凋亡信號調節激酶(ASK1)來觸發細胞凋亡。ATF6是UPR的關鍵調節因子，既可以通過誘導CHOP的表達，驅動細胞凋亡機制；也可以通過調節ERS期間的蛋白質折疊能力促進細胞存活。本研究結果提示RFP可以激活GRP78以及PERK-ATF4-CHOP、IRE1-XBP1、ATF6 3條UPR信號通路，并且MANF敲低后，上述激活效應進一步加強，同時細胞損傷加重。這說明MANF可能通過調節UPR，恢復內質網穩態，來發揮細胞保護作用。有文獻報道MANF可以通過抑制ERS的凋亡信號通路來介導細胞保護作用，本研究結果與之一致。

MANF是ERS最敏感的基因，具有獨特的三維結構，N端saposin樣結構域和C端SAP(SAF-A/B，Acinus and PIAS，SAP)結構域，MANF的C末端與Ku70的SAP結構域同源，Ku70是促凋亡Bax蛋白的抑制劑，發揮抗細胞凋亡的作用，因此推測MANF的SAP結構域與其抗凋亡作用有關。遇到炎癥和ERS時，MANF通過C端SAP結構域與核因子-κB(NF-κB)p65亞基的DNA結合結構域相互作用而負調控NF-κB通路，從而起到抑制炎癥反應的作用。本次體外研究顯示：RFP可以誘導MANF的蛋白及基因表達；敲低MANF后，HepG2細胞凋亡率升高，細胞增殖能力降低。此研究結果可以證明ERS增加了MANF的表達和分泌以及MANF在RFP誘導HepG2細胞損傷中發揮細胞保護作用，這可能和MANF有抗細胞凋亡與抑制炎癥反應作用有關。Yang et al研究發現：MANF基因缺失激活了ATF4/CHOP和JNK/c-JUN/CHOP信號通路，并且加重了肝缺血再灌注誘導的肝損傷，本研究得出的結論與之基本一致。

ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL是臨床上反映肝功能狀態的重要指標，細胞培養上清液中ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL的含量與細胞損傷程度密切相關。本研究觀察到RFP可以誘導細胞培養上清液中細胞損傷標志物ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL水平升高，并且MANF敲低后這些指標進一步升高，間接說明敲低MANF加重了RFP對HepG2細胞的損傷。與敲低MANF升高了HepG2細胞凋亡率及降低了細胞增殖能力這些結果相結合，可以進一步說明MANF有細胞保護作用。